1、升清胶囊下调胆囊结石豚鼠胆囊上皮组织雌、孕激素受体【摘要】 研究雌激素受体和孕激素受体在胆固醇结石形成中的作用及升清胶囊对其表达的影响。 方法：将 80 只雌性豚鼠随机分为正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组和升清胶囊组，每组 20 只。除正常对照组外，采用高脂致石饮食法建立胆囊胆固醇结石模型。升清胶囊组和熊去氧胆酸组豚鼠分别灌胃相应药物。造模 7 周后观察各组豚鼠胆囊成石情况，并采用免疫组织化学法检测豚鼠胆囊上皮组织雌、孕激素受体的表达。 结果：升清胶囊可降低造模豚鼠的成石率，与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05） 。按正常对照组、升清胶囊组、熊去氧胆酸组和模型组的顺序，各组豚鼠胆囊组织雌
2、、孕激素受体阳性表达半定量分级逐级升高，升清胶囊组与模型组、熊去氧胆酸组比较差异有统计学意义（P0.05） 。各组间雌、孕激素受体阳性表达率比较，差异有统计学意义（P0.05） 。 结论：疏肝利胆方药升清胶囊可下调雌、孕激素受体的表达，降低胆固醇结石形成。 【关键词】 雌激素受体 孕激素受体 胆固醇结石 豚鼠 升清胶囊Objective: To study the role of estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) in the formation of cholesterol calculus and investiga
3、te the effects of Shengqing Capsule (SQC), a Chinese patent herbal medicine with the function of soothing liver and draining gallbladder, on ER and PR expressions.Methods: A total of 80 female guinea pigs were divided into normal control group, untreated group, ursodeoxycholic acid group (UDCA group
4、) and SQC group. The cholesterol gallstone was induced by feeding the guinea pigs with highfat lithogenic diet. SQC and UDCA were separately administered to the guinea pigs in the SQC group and UDCA group. After 7week administration, all the animals were sacrificed to calculate the incidence of calc
5、ulus formation and detect the expressions the ER and PR in the epithelial tissue of gallbladder by immunohistochemical method.Results: Gallstone was cholesterol calculus detected by infrared spectrum. The incidence of calculus formation in the SQC group (27.78%) was significantly lower than that in
6、the untreated group (81.25%) (2=9.721 5, P=0.001 8). On the basis of Reiner standard, the expression distribution of ER and PR increased gradually from the normal control group through the SQC group and UDCA group to the untreated group. Except for the former two groups and the latter two groups, th
7、e differences between the other groups and UDCA group were statistically significant (P0.05). Besides, the differences of positive expression rates between groups were statistically significant (P0.05).Conclusion: Increased expressions of ER and PR are closely related to the formation of cholesterol
8、 stone. And Shengqing Capsule can downregulate the expressions of ER and PR.Keywords: estrogen receptor; progesterone receptor; cholesterol calculus; guinea pigs; Shengqing Capsule胆石病是临床常见病，流行病学研究显示中年女性胆石病的发生率显著高于同年龄段男性1 。目前已有研究证实，雌性激素（主要包括雌二醇、孕酮等）水平升高可增加胆石病发生的风险2 。那么，雌性激素受体是否同步参与了胆石病的形成？而疏肝利胆方药对胆石病
9、具有肯定的疗效，这种疗效是否与其干预雌性激素的表达有关？本课题组采用辣根过氧化物酶抗过氧化物酶（horseradish peroxidase antiperoxidase, PAP）复合物法对胆固醇结石豚鼠胆囊组织雌性激素受体进行检测，探讨雌性激素受体表达与成石的关联以及疏肝利胆方药的干预作用。1 材料与方法1.1 实验动物 白色红目雌性豚鼠，清洁级，体质量（22020）g，共 80 只，由上海中医药大学动物实验中心提供，合格证号为 0026358。1.2 实验药物 疏肝利胆方药采用升清胶囊（Shengqing Capsule, SQC） ，由大黄、虎杖和陈皮等组成，0.3 g/粒，新药证书编
10、号为国药证字 Z20030053，上海中医药大学龙华医院制剂室提供干粉剂。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA） ，50 mg/片，由上海三维长江生化制药有限公司生产，批号为 20040502。1.3 胆固醇结石模型制备 采用高脂致石饮食法建立胆固醇结石模型3 。致石饲料主要成分为玉米粉 15%、黄豆粉 10%、面粉 10%、鱼粉 3%、麸皮 10%、食盐 1%、酵母粉 1%、苜蓿粉 40%、酪蛋白 2%、猪油2%、蔗糖 5%及胆固醇 1%。由上海申旺实验动物中心提供。胆囊内有块状或絮状沉淀物，并经红外光谱分析证明为胆固醇性质者为造模成功。1.4 主要试剂与仪器 鼠
11、单克隆雌激素受体(estrogen receptor, ER)抗体（sc787 ）与鼠单克隆孕激素受体(progesterone receptor, PR)抗体（sc538 ）均购于美国 Santa Cruz 公司。RM2145 型切片机、HI1210 型展片机和 HI1220 型烤片机（德国 Leica 公司生产） ，Olympus CX31 型光学显微镜（日本 Olympus 公司生产） 。1.5 动物分组与处理 80 只豚鼠常规适应性喂养 1 周后，采用随机数字表分为正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组和升清胶囊组，每组20 只。正常对照组豚鼠喂食正常饲料、少量青菜及生理盐水。模型组予造模饲
12、料、少量青菜及等容量的生理盐水。熊去氧胆酸组和升清胶囊组分别予造模饲料、少量青菜和相应药物灌胃。给药量按体表面积法计算，升清胶囊给药量 0.161 g/(kgd)、熊去氧胆酸给药量 40.25 mg/(kgd)，2 次/d 灌胃，连续 7 周。1.6 取材 灌喂第 49 天，所有豚鼠禁食 12 h，于次日晨 8 时用2戊巴比妥钠 60 mg/(kgd)腹腔注射麻醉，以新洁尔灭酊消毒皮肤后开腹，取出胆囊，观察胆囊成石情况，计算胆囊成石率，并取出结石，采用红外光谱分析法进行胆石定性。1.7 免疫组化法检测 ER 和 PR 表达 剪取各组豚鼠胆囊组织 0.5 cm0.5 cm，用 10甲醛固定，常规
13、石蜡制片，厚度 5 m，全部标本进行免疫组化 PAP 染色，苏木素复染，封片，光学显微镜下观察胆囊组织 ER 阳性细胞与 PR 阳性细胞的染色情况。每组均用 ER 阳性及 PR 阳性乳腺癌组织切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution, PBS）代替一抗，作阴性对照。1.8 结果判定 细胞内出现棕黄色至深棕色颗粒者为 ER 或 PR 阳性细胞。ER、PR 的免疫组化染色结果判定参考 Reiner 标准4 ，结合染色程度及阳性细胞分布情况，分为()、()、()、() 4 个等级。1.9 统计学方法 应用 SPSS 11.0 统计软件对实验结果进行 2检
14、验及 Ridit 分析。2 结 果2.1 各组豚鼠胆囊结石生成情况 肉眼观察见豚鼠胆囊内有块状或絮状沉淀物，并经红外光谱检测在 1 466、1 377 和 1 050 cm1 处有较强的吸收峰，鉴定为胆固醇性质结石。正常对照组中 1 只豚鼠无胆囊，其余 19 只中有 1 只豚鼠发现胆结石，成石率 5.26%；模型组 4 只死亡，16 只豚鼠中有 13 只有胆结石，模型组成石率为 81.25%，显著高于正常对照组（2=20.896 4，P=0.000 0） ；升清胶囊组和熊去氧胆酸组均有2 只豚鼠死亡，并分别有 5 只和 7 只豚鼠有胆结石，成石率分别为 27.78%和38.89%，均明显低于模
15、型组（2=9.721 5，P=0.001 8 和 2=6.275 5，P=0.012 2） 。2.2 各组豚鼠胆囊组织 ER 阳性表达率及半定量分级情况 正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组和升清胶囊组豚鼠胆囊组织 ER 阳性率分别为 26.3%、68.8%、66.7%和 33.3%，组间阳性率比较差异有统计学意义（2=12.241 3，P=0.006 6） 。各组豚鼠胆囊组织 ER 阳性表达半定量分级按照正常对照组、升清胶囊组、熊去氧胆酸组和模型组的顺序逐渐升高，除正常对照组与升清胶囊组之间比较、熊去氧胆酸组与模型组之间比较差异无统计学意义（P0.05）外，其余各组之间比较差异均有统计学意义（P
16、0.05） 。见表 1 和图 1。2.3 各组豚鼠胆囊组织 PR 阳性表达率及半定量分级情况 正常对照组、模型组、熊去氧胆酸组和升清胶囊组豚鼠胆囊组织 PR 阳性率分别为 15.8%、62.5%、61.1%和 38.9%，组间阳性率比较差异有统计学意义（2=12.306，P=0.006 4） 。各组豚鼠胆囊组织 PR 阳性表达半定量分级按照正常对照组、升清胶囊组、熊去氧胆酸组和模型组的顺序逐渐升高，除正常对照组与升清胶囊组之间比较、熊去氧胆酸组与模型组之间比较差异无统计学意义（P0.05）外，其余各组之间比较差异均有统计学意义（P0.05） 。见表 2 和图 2。表 1 各组豚鼠胆囊上皮组织
17、ER 阳性表达率及半定量分级情况表 2 各组豚鼠胆囊上皮组织 PR 阳性表达率及半定量分级情况3 讨 论近年来，随着生活水平的提高和饮食结构的改善，胆固醇结石发病率大幅度上升。胆固醇代谢异常，肝脏胆固醇输出过多是胆固醇结石形成的基础。目前治疗胆固醇结石的一线药物熊去氧胆酸，主要通过增加胆汁酸的分泌，促进胆固醇的转化，起到溶石作用。近年来，雌性激素及其受体在胆固醇代谢中的重要作用逐渐得到重视。3.1 雌性激素及受体参与胆固醇结石的形成 国内外流行病学调查与临床研究均显示女性胆囊胆固醇结石发病率显著高于男性5, 6 ，雌激素被认为是胆固醇结石形成的一个重要危险因素。雌性激素与其相应的受体结合进入细
18、胞核，诱导功能不同的蛋白质的合成，从而产生多种生物学效应。 （1）增加胆汁胆固醇饱和度。实验证实卵巢切除的抗成石小鼠应用外源性雌激素以后，可在肝脏中通过雌激素 雌激素 受体 胆固醇调节元件结合蛋白 2 途径合成胆固醇，分泌入胆汁，导致胆汁胆固醇过饱和，胆囊胆固醇结石易于形成7, 8 。 （2）影响胆囊排空功能。应用雌激素替代治疗的绝经期女性空腹胆囊容积与胆囊收缩后残余容积都增加，胆囊胆汁的喷射指数下降9 。妊娠期空腹胆囊容积和收缩后容积随孕酮浓度升高而增加，胆囊对胆囊收缩素的敏感性随孕酮浓度升高而下降10 。 （3）促使胆固醇结石核心形成。雌激素可增加豚鼠胆囊黏膜表面分泌颗粒及胆汁中钙浓度，黏
19、蛋白、钙的复合物和胆囊黏膜的脱落上皮细胞粘合在一起形成结石核心11 。本研究发现，正常胆囊组织 ER 及 PR 多呈阴性及弱阳性表达，采用高脂致石饮食建立的胆固醇结石模型豚鼠胆囊组织 ER 及 PR 表达率显著提高，提示雌激素受体参与了胆囊胆固醇结石形成的病理过程。3.2 疏肝利胆方药升清胶囊对雌性激素受体的干预作用 胆石病根据其主要症状归属于中医“胁痛” 、 “肝胀” 、 “胆瘅” “癖黄” 、 “胆胀” 、“黄疸” 、 “胃脘痛”和“结胸”等范畴。对慢性胆道感染和胆石病进行的辨证分析发现，胆石病中肝胆气郁者占 44.53，给予疏肝利胆法治疗有效率达 86.8212 。在此基础上，龙华医院胆
20、道外科结合临床经验成功研制了用于治疗肝胆气郁型胆石症的中成药升清胶囊。该药由生大黄、虎杖和陈皮等中药组成。研究发现，升清胶囊具有抗炎、镇痛、利胆和溶石等作用，并能改善炎症导致的胆囊黏膜结构病理性改变，减少胆固醇对胆囊平滑肌的进一步侵害13, 14 ，还可通过调节肝组织中胆固醇、胆红素代谢相关酶的基因表达，抑制致石性胆汁形成15 ，因而升清胶囊也具有一定程度的防止胆结石形成作用。中药复方是多种成分的混合制剂，其疗效的发挥往往是通过多层次、多靶点的综合作用体现出来的。本研究中，经升清胶囊和熊去氧胆酸治疗后，两组豚鼠胆囊组织 ER 及 PR 阳性率均有所下降，但两组之间下降幅度有一定差异。这表明升清
21、胶囊可能通过下调雌性激素受体的表达降低雌激素对胆固醇结石形成的促进作用，这可能是升清胶囊治疗胆石病作用机制的又一方面。【参考文献】1 Vlzke H, Baumeister SE, Alte D, et al. Independent risk factors for gallstone formation in a region with high cholelithiasis prevalence. Digestion. 2005; 71(2): 97105.2 Cirillo DJ, Wallace RB, Rodabough RJ, et al. Effect of estrogen
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