1、生脉拆方系列注射液的制备及质量标准研究作者：李国信,张会宗,刘晶,刘君 【摘要】 目的 对生脉注射液不同拆方配伍制备的注射液进行制备工艺及质量标准研究,为生脉注射液在体药物配伍关系研究提供物质基础及质量保证。方法 参照生脉注射液制备方法,规范了 7 种注射液的制备工艺,并采用 HPLC 及 TLC 法分别对系列注射液人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1、五味子醇甲及麦冬药材进行定量或定性分析。结果 人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re 在 0.942 49.424 g 与 0.6246.24 g范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系(r10.999 5、r20.999 7),平均回收率
2、为 97.0%100.4%,RSD 为 0.45%3.44%。TLC 检出人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、五味子醇甲成分及麦冬对照药材主斑点。结论 本试验确定的制备工艺稳定,质量控制方法便捷,结果准确可靠、重现性好,可为生脉注射液在体药物配伍关系研究提供试验基础与保证。 【关键词】 生脉注射液；人参皂苷 Rg1；人参皂苷 Re；人参皂苷Rb1；五味子醇甲；高效液相色谱法；薄层色谱法Abstract：Objective To study the preparation and quality standard of series of Shengmai Injection, a
3、nd supply substantial basis and quality assurance for compatibility relation research on traditional Chinese medicine in vivo. Methods According to the preparing process of Shengmai Injection, preparing processes for 7 dismantlement injections were established. HPLC and TLC methods were used for qua
4、litative analysis and quantitation determination of Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Re, Ginsenoside Rb1, Schisandrin and Radix Ophiopgonis. Results The linear ranges of Ginsenoside Rg1 and Ginsenoside Re were 0.942 49.424 g (r0.999 5) and 0.6246.24 g (r0.999 7). The average recovery was 97.0%100.4%, an
5、d RSD was 0.45%3.44%. The main spots of Ginsenoside Rg1, Ginsenoside Re, Ginsenoside Rb1, Schisandrin and Radix Ophiopgonis were identified by TLC method. Conclusion The preparation processes are stable. The method of quality control was showed rapid, reliable and well reproducible. It set a good ba
6、sis for the compatibility study on Shengmai Injection in vivo.Key words：Shengmai Injection；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Ginsenoside Rb1；Schisandrin；HPLC；TLC探讨中药复方发挥整体效应的物质基础及药味配伍关系是现代中药学研究的热点。为了开展此方面的研究工作,本试验选定生脉注射液为示范性研究制剂。在统一药材批次、固定处方比例、规范制备条件的前提下,参照卫生部药品标准(中药成方制剂)“生脉注射液”项下制备方法1,分别制备 7 种注射液,并制定其
7、质量控制标准,为方中红参、麦冬、五味子 3 味中药群体组分在体研究的均一性和可比性提供基本保障,同时为方中药味在体生脉注射液指纹谱的识别与归属、色谱峰的消长变化与药物配伍关系的评定提供良好的物质基础和技术保证。1 仪器与试药Waters 高效液相色谱仪(美国),LC-10UV 检测器,JS-3030 型色谱工作站。人参皂苷 Rg1(批号 110703-200424)、人参皂苷 Re(批号 110754-200421)、人参皂苷 Rb1(批号 110704- 200420)、五味子醇甲(批号110857-200507)、麦冬对照药材(批号 121013-200607),均由中国药品生物制品检定所
8、提供；生脉系列注射液由辽宁省中医药研究院药学研究室制备。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,磷酸及其他试剂均为分析纯。2 生脉系列注射液的制备2.1 红参注射液取红参 100 g,粉碎成细粒,用乙醇回流提取 5 次,每次 2 h,合并提取液,冷藏,滤过,滤液浓缩至稠膏状。加入注射用水至 400 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加注射用水至 1 000 mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.2 麦冬注射液取麦冬 312 g,加水煎煮 3 次,每次 40 min。合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行 2 次醇沉,第 1 次使含醇量达 80%,第 2 次使含醇量达 85%。滤
9、过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状。加入注射用水约 200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸 30 min,稍冷,过滤至澄明,加注射用水至 1 000 mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.3 五味子注射液取五味子 156 g,水蒸气蒸馏法收集馏液 150 mL,冷藏,供配液用。药渣加水煎煮 3 次,每次 40 min。合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行两次醇沉,第 1 次使含醇量达 80%,第 2 次使含醇量达 85%。滤过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状。加入注射用水至 200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸 30 min
10、,稍冷,过滤至澄明,滤液加入蒸馏液及注射用水至 1 000 mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.4 参味注射液取红参 100 g、五味子 156 g,分别按照“2.1” 、 “2.3”项下方法制备至“加注射用水至 1 000 mL”前。合并上述红参水液、五味子蒸馏液、五味子水液,混合均匀,滤过,滤液加注射用水至 1 000 mL,调节药液pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.5 参麦注射液取红参 100 g、麦冬 312 g,分别按照“2.1” 、 “2.2”项下方法制备至“加注射用水至 1 000 mL”前。合并上述红参水液、麦冬水液,混合均匀,滤过,滤
11、液加注射用水至 1 000 mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.6 麦味注射液取麦冬 312 g、五味子 156 g,分别按照“2.2” 、 “2.3”项下方法制备至“加注射用水至 1 000mL”前。合并上述麦冬水液、五味子蒸馏液、五味子水液,混合均匀,滤过,滤液加注射用水至 1 000mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,灭菌,即得。2.7 生脉注射液取红参 100 g、麦冬 312 g、五味子 156 g,将红参粉碎成细粒,用乙醇回流提取 5 次,每次 h,合并提取液,冷藏,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入注射用水至 400 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液
12、供配液用；五味子用水蒸气蒸馏法收集馏液 150 mL,冷藏,供配液用,药渣加水煎煮 3 次,每次 40 min,合并煎液,滤过,滤液浓缩至稠膏状,加入乙醇进行 2 次醇沉,第 1 次使含醇量达 80%,第 2 次使含醇量达 85%,滤过,合并滤液,回收乙醇并浓缩至稠膏状,加入注射用水至 200 mL,搅匀,冷藏,滤过,滤液加适量活性碳煮沸 30 min,稍冷,过滤至澄明,供配液用。麦冬照五味子水液制备方法制成澄明的麦冬水溶液约 200 mL,供配液用。将上述红参水液、五味子蒸馏液、五味子水液和麦冬水液混合均匀,滤过,滤液加注射用水至 1 000 mL,调节药液 pH 值至 7.5,滤过,灌封,
13、灭菌,即得。3 生脉系列注射液质量标准研究3.1 定性鉴别3.1.1 红参 分别取生脉注射液、参麦注射液、参味注射液、红参注射液 5 mL,水浴蒸干,残渣加甲醇 1 mL 使溶解,作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1、Re、Rg1 对照品,加乙醇制成每 1 mL 各含 2 mg 的混合溶液,作为对照品溶液。照 2005 年版中华人民共和国药典附录B 试验,精密吸取上述 5 种溶液各 24 L,分别点于同一硅胶薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15402210)10 以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,在 105 烘数分钟,置紫外光灯(365 nm)下检
14、视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。3.1.2 麦冬 分别取生脉注射液、参麦注射液、麦味注射液、麦冬注射液 40 mL,加盐酸 3 mL,置水浴中加热 1 h,放冷,加乙醚振摇提取 2 次,每次 30 mL,合并醚液,蒸干,残渣加三氯甲烷 1 mL 使溶解,作为供试品溶液。另取麦冬对照药材 2 g,加水煎煮 30 min,滤过,滤液浓缩至约 40 mL,同法制成对照药材溶液。照 2005 年版中华人民共和国药典附录B 试验,吸取上述5 种溶液各 510 L,分别点于同一硅胶薄层板上,以三氯甲烷-丙酮(41)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,在
15、 105 烘约5 min。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。3.1.3 五味子 分别取生脉注射液、参味注射液、麦味注射液、五味子注射液 50 mL,水浴浓缩至约 25 mL,移至分液漏斗中,加三氯甲烷振摇提取 3 次,每次10 mL,滤过,合并滤液,水浴蒸至近干,残渣加甲醇 1 mL 使溶解,作为供试品溶液。另取五味子醇甲对照品,加甲醇制成每 1 mL 含 0.5 mg 的溶液,作为对照品溶液。照 2005 年版中华人民共和国药典附录B 试验,吸取上述供试品溶液 45 L、对照品溶液 12 L,分别点于同一硅胶GF254 薄层板上,以石油醚(3060 )-甲酸乙酯
16、-甲酸(1451)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。3.2 含量测定3.2.1 色谱条件 色谱柱：XB-C18(4.6 mm250 mm,5 m)；柱温：常温；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(1981)；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；理论塔板数按人参皂苷 Rg1 色谱峰计应不低于 5 000。3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的人参皂苷 Rg1 23.52 mg 和人参皂苷 Re 15.60 mg,置 25 mL 量瓶中,加乙腈-水(19
17、81)至刻度,摇匀,精密量取 5 mL 置 10 mL 量瓶中,加乙腈-水(1981)稀释至刻度,摇匀,即得(每 1 mL 含人参皂苷 Rg1 0.471 2 mg、人参皂苷 Re 0.312 mg)。3.2.3 供试品溶液的制备 分别精密量取生脉注射液、参麦注射液、参味注射液、红参注射液各 25 mL,水浴蒸干,残渣加流动相溶解,并定量转移至 5 mL 量瓶中,稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。3.2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液 2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 L,注入高效液相色谱仪。以进样量为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程：YRg11.42210
18、-6XRg10.091 2(r0.999 5)；YRe1.67610-6XRe0.036(r0.999 7)。结果表明：人参皂苷 Rg1 与人参皂苷 Re 进样量分别在0.942 49.424 g、0.6246.24 g 范围内与峰面积呈良好线性关系。3.2.5 精密度试验 精密吸取同一样品供试品溶液 20 L,连续进样 6 次,测定人参皂苷 Rg1 与人参皂苷 Re 峰面积。结果 4 种样品 2 种成分峰面积精密度 RSD在 1.32%1.58%范围内,说明精密度良好。3.2.6 稳定性试验 取每种注射液同一样品供试液,分别于 0、2、4、6、8 h 检测。结果人参皂苷 Rg1 与人参皂苷
19、Re 测定在 8 h 内稳定,RSD 在 1.29%1.83%范围内。3.2.7 重复性试验 取每种注射液同一批样品,精密吸取 6 份,平行制备供试品溶液并进样测定。结果 RSD 在 1.79%2.95%范围内。3.2.8 加样回收率试验 采用加样回收法。精密称定 4 种注射液已知含量的同一批样品 9份,每份 12.5 mL,每 3 份 1 组,分别按样品含量 80%、100%、120%加入对照品溶液(人参皂苷 Rg1 0.471 2 mg/mL；人参皂苷 Re 0.312 mg/mL),制备供试品溶液,测定,结果平均回收率在 97.0%100.4%,RSD 在0.45%3.44%范围内。结果
20、见表 1。表 1 加样回收率试验结果（略）3.2.9 样品含量测定精密吸取对照品溶液 10 L、各供试品溶液 20 L,分别注入液相色谱仪,测定,计算,即得。色谱图见图 1。含量测定结果见表 2。表 2 4 种注射液含量测定结果(略)4 讨论本试验参照现代血清药理学、血清化学及中药药代动力学研究的思路与方法2-3,通过制备系列注射液,在组方药材质量可控条件下,固定处方配伍比例,制备工艺稳定的系列注射液,并对注射液的质量建立控制标准。结果显示,本试验确立的定量、定性方法便捷、准确,重现性好,可为生脉系列注射液在体化学成分色谱指纹谱的比较及色谱峰的归属研究打下良好基础,赋予色谱图以特征性,通过指纹
21、谱色谱峰的变化来诠释药物的配伍关系。另外,本试验参照有关文献1,将红参 TLC 鉴别三氯甲烷-甲醇-水(75202)展开系统更改为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15402210)系统,使得人参皂苷 Rb1、Re、Rg1 具有较适宜 Rf 值和较好的分离效果,生脉注射液、参麦注射液、参味注射液 TLC 谱显示,在与人参皂苷 Re 相同 Rf 处,略有黄色杂质斑点,这可能与样品制备过程活性碳吸附效果有关；五味子的定性鉴别将三氯甲烷溶解更改为甲醇溶解制备供试液,亦收到较好的试验效果。【参考文献】1 中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准(中药成方制剂)S.第十五册.1999.50.2 曹 进,叶兆波,车镇涛.抗衰老复方化学配伍关系的指纹谱研究J.中草药,2006,37(5)：691.3 潘卫松,刘美凤,石 钺,等.血清药理学、血清化学和中药药代动力学J.世界科学技术中药现代化,2002,4(3)：53.
