噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定.doc

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1、噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定作者:张旭 彭健 王顺伟 杨璞 于丽 胡玉 张阳德 【摘要】 目的: 通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定. 方法: 以 L02 为阴性消减细胞, HepG2 为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行 4 轮消减筛选. 并随机挑取 26 个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析. 以ELISA 法鉴定噬菌体与 HepG2 细胞的结合活性. 通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定 H3 噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性. 人工合成短肽 HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性. 结果:

2、4 轮筛选使噬菌体在靶细胞 HepG2 上出现明显富集. 所挑取的 26 个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生 5 条氨基酸序列. 经 BLAST 分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子. ELISA 分析鉴定显示,5 个阳性克隆在HepG2 和 L02 细胞上有差异性结合,其中 H3 噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大. 免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3 噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞. 免疫荧光显色证实,FITCHBP3 能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质. 结论: H3 噬菌体克隆所呈现的

3、七肽 HBP3 能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础. 【关键词】 肝肿瘤;肿瘤细胞;噬菌体肽库;消减筛选;短肽 0 引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升趋势. 其治疗主要以手术、化疗和放疗为主,但疗效都不是很理想1-2. 因而迫切需要有创新性、突破性的早期治疗手段,而肿瘤基因疗法为此提供了一条新思路. 目前,无论是离体基因治疗,还是体内基因治疗,实际的治疗效果仍然不能令人满意. 如何进一步提高基因治疗的靶向性,从而实现基因的高效表达是其重要的技术障碍. 为此,使用不同筛选

4、方法获得肝癌细胞特异性结合分子,已成为提高肝癌基因治疗效果的重要途径之一. 近年来,噬菌体表面呈现技术已被不断地发展和完善,并被广泛用于筛选多肽及蛋白质. 它将外源蛋白的基因型与表型联系在一起,把与其他分子的结合活性和噬菌体的可扩增性统一起来,科学家们已成功构建了多种类型的噬菌体随机肽库3-4. 利用噬菌体肽库进行筛选,不需预先知道受体分子的结构信息,能够得到一些与低浓度靶分子特异结合的短肽,是一种高效的筛选体系5. 因此,我们以人正常肝细胞(L02 )为消减细胞,利用噬菌体展示技术,通过对体外培养人肝癌细胞(HepG2)的筛选,旨在得到一批能与人肝癌细胞特异性结合的七肽,为肝癌的靶向治疗提供

5、新的候选分子. 1 材料和方法 1.1 材料人肝癌细胞株 HepG2 及人正常肝细胞株 L02 :国内建系,本实验室细胞库冻存. HBP3 人工合成肽H3 噬菌体呈现短肽,及无关噬菌体(URPs)插入片段的人工合成短肽 URBP 均由上海生工公司依照 HBP1的氨基酸序列合成的,并于末端标记 FITC,纯度为 98%,于-20保存. 噬菌体随机七肽库(Ph.D.-7TM Phage display peptide library)购自New England Biolabs 公司. 大肠杆菌 E.coli ER2738 购自 New England Biolabs 公司. M13 噬菌体单链 D

6、NA 提取试剂盒购自上海华舜生物公司. ELISA TMB 显色试剂盒购自万泰生物药业. 鼠抗 M13 mAb, HRP 标记的鼠抗 M13 mAb 购自 Pharmacia Biotech 公司. 1.2 方法 1.2.1 噬菌体随机七肽库的体外消减筛选以 L02 细胞为阴性消减细胞,HepG2 细胞为靶细胞,参照噬菌体随机肽库的使用说明书6 、优化改良筛选方法,进行 4 轮消减筛选,并逐渐增加筛选压力. 所得噬菌体经扩增、滴定,取 21011pfu 投入下一轮筛选. 每轮噬菌体投入量均为21011pfu,共进行 4 轮筛选. 并逐渐增加筛选强度:与阴性细胞孵育的时间先后增加至 1.25,1

7、.5,2 h,与靶细胞的孵育时间先后减为45,30,15 min;TBST 混旋洗涤次数也相应地增至 4,6,8 次. 1.2.2 阳性噬菌体克隆的挑选经 4 轮体外筛选所得的噬菌体滴定后铺制 LB 平板,并挑取噬菌体单克隆,以备测序、鉴定. 将经筛选所得的噬菌体液感染宿主菌 E.coli ER2738,铺制 LB/IPTG/Xgal 平板,37,过夜培养;在长出蓝色噬菌斑的平板上,用无菌 Tip 头随机挑取 26 个噬菌体克隆;将 26 个噬菌体克隆分别加入已摇至对数前期的 ER2738 菌液中,37,300 r/min,剧烈扩增 2 h;将噬菌体单克隆扩增液分别离心(4,9000 r/mi

8、n, 5 min) ,取其上清,保存于 4. 1.2.3 单克隆噬菌体 DNA 序列的测定分析按华舜公司 M13 单链 DNA 提取试剂盒操作说明书提取噬菌体单链 DNA. 以单链 DNA 为模板,采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的-96 测序引物(5HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG3 ) ,在 ABI 310DNA 自动测序仪上进行自动测序. 测序工作由上海生工有限公司完成. 比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性,登陆 NCBI/BLAST, ClustalW 等网站,将推导出的氨基酸序列同数据库中已知蛋白质的氨基酸序列进行同源性分析. 1.2.4ELISA 法鉴定所选

9、噬菌体单克隆与 HepG2 细胞的结合特异性根据测序结果,以 L02 细胞为对照,用常规 ELISA 法7鉴定测序成功的噬菌体克隆与 HepG2 细胞的结合活性,选出与 HepG2 细胞能特异性结合的噬菌体克隆,作为进一步研究的候选克隆,同时排除假阳性或无差异结合的噬菌体. 并设 PBS 对照及原始文库噬菌体对照. 实验重复 3 次,计算平均 A 值及结合特异性. 1.2.5H3 噬菌体克隆结合特异性鉴定常规方法制备细胞爬片,以L02 细胞为对照细胞,采用免疫细胞化学染色方法(ABC 法)鉴定 H3噬菌体克隆在 HepG2 细胞与对照细胞上结合活性的差异. 以人正常肝组织为对照,按常规免疫组织

10、化学染色程序鉴定 H3 噬菌体克隆在肝癌组织与对照组织结合活性的差异. 于光学显微镜下观察染色结果,参照Shimizu 等8的评分方法,依据棕色反应的阳性强度及阳性细胞的比例综合判断. 1.2.6HBP3 合成短肽结合特异性检测采用免疫荧光技术鉴定FITCHBP3 合成短肽与 HepG2 细胞、L02 细胞结合的特异性,后者作为阴性对照细胞. 无关噬菌体(URPs)插入片段的人工合成短肽(FITCURBP )分别与上述 4 种细胞反应,作为阴性对照组. 细胞爬片经正常血清封闭后,加入 100 mg/L FITCHBP3 100 L, FITCURBP合成短肽,37孵育 1 h,振荡洗涤 5 m

11、in3 次,于荧光显微镜下观察比较. 统计学处理: 所有数据用 SPSH12.0 处理,计量资料均用 xs 形式表示;对于非四格表资料采用 2 检验. P0.05 为差异具有统计学意义. 2 结果 2.1 体外筛选使噬菌体在人肝癌细胞上富集 4 轮体外筛选中,每次投入的噬菌体量均相同,即 21011pfu,回收噬菌体的滴度由第 1 轮的0.532104pfu 增加到第 4 轮筛选后的 5.661106pfu,增加了 1065 倍,回收率也显著提高,由第 1 轮的 0.31610-7 增至第四轮筛选后的2.82910-5. 同时,噬菌体在对照细胞 L02 上则保持低水平的结合或有不同程度的减少,

12、由第 1 轮的 3.56710-7 降至第 4 轮的 0.53810-7. 筛选结果说明,与对照细胞 L02 相比,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集(P0.05,图 1). 图 1 体外筛选后噬菌体在 HepG2 与 L02 细胞上富集量的比较 2.2 噬菌体 DNA 的序列测定及同源性分析分别将所挑取的噬菌体单克隆及其所插入的随机片段依次命名为 H1H26. 测序结果最终产生 5 条核苷酸序列,其本质是 5 个噬菌体克隆的插入片段,分别为H1,H3,H8,H11,H15. 根据氨基酸密码子,将 5 个插入片段翻译成氨基酸,即为噬菌体所呈现的随机短肽,并命名为 HBP(hepatoma cel

13、ls binding peptide,表 1). 分析 5 个插入片段氨基酸序列的同源性,没有发现普遍的共有序列. 表 1 测序得到 5 个插入片段及其相应的短肽噬菌体克隆 2.3ELISA 法鉴定噬菌体克隆与 HepG2 细胞的结合活性利用 ELISA 法,对 5 个噬菌体克隆在 HepG2 细胞上的结合特异性进行了反复鉴定. 对ELISA 结果进行统计学分析,得出 5 个噬菌体克隆在 HepG2 细胞和 L02细胞上的结合活性均有差异(P0.05) ,其中 H3 噬菌体的结合特异性最高,因此选择对该噬菌体克隆进行研究(图 2). 图 2 噬菌体克隆与 HepG2 细胞结合特性的 ELISA

14、 鉴定 2.4H3 噬菌体结合活性的鉴定 H3 噬菌体免疫细胞化学染色结果显示,HepG2 细胞上呈现阳性,以胞膜、核周胞质为著,人正常肝细胞 L02 为阴性,说明 H3 噬菌体能特异性、高亲和力地结合于人肝癌细胞株,而与人正常肝细胞 L02 不结合(图 3). H3 噬菌体免疫组织化学染色结果显示,肝癌组织呈阳性反应,而人正常肝组织为阴性,表明该噬菌体能够与肝癌组织特异性结合(图 4). 2.5FITCHCBP3 与 HepG2 细胞的特异结合 FITCHCBP3 合成短肽的免疫荧光检测结果显示,FITCHCBP3 结合于 HepG2 细胞的胞膜和胞质,发出绿色荧光,而 L02 细胞未见明显

15、荧光(图 5). 这说明此人工合成短肽确实能与人肝癌细胞特异结合. 3 讨论 噬菌体随机肽库筛选是一项选择技术9-10 ,其基本原理是将有一定规律的外源基因插入到噬菌体基因组中,外源基因编码的多肽或蛋白质分子融合于噬菌体包膜蛋白上,由此建立的噬菌体表达文库可用于亲和筛选,得到能与目标分子特异结合的多肽或蛋白,这就在基因与蛋白质或多肽间建立了一座桥梁,可高通量分析细胞蛋白质成分及其功能,用于分子之间相互识别,且在不知道受体分子任何结构信息的情况下,对于纳摩尔级的靶分子亦能筛选出具有高亲合力的配体,是一种高效、快捷的筛选体系. 获得在不同生长周期和多种微环境下的肿瘤细胞中能够长时间高效表达、而在正

16、常细胞低表达或不表达的靶分子是常用药物靶点的重要指标. 由于肿瘤细胞表面分子标志物的未知性和低表达量使其难于检测、分离和纯化,而噬菌体随机肽库筛选技术正具有这方面的优势,因而,我们以此原理为基础,以 HepG2 为靶细胞,L02 为阴性细胞,选用噬菌体随机七肽库进行四轮全细胞消减筛选. 我们将筛选所得的 26 个噬菌体克隆进行测序,获得其外源性插入片段的核苷酸序列及短肽序列,最终获得 5 个噬菌体克隆及短肽(HBP)序列. 对 5 条短肽序列进行氨基酸同源性比较,没有发现普遍的共有序列. 5 条短肽与蛋白数据库中已知蛋白质进行同源性分析,未发现含有与短肽氨基酸序列完全一致或是与其有良好同源性的

17、蛋白质分子. 用 ELISA 法对噬菌体克隆进行鉴定,发现 5 个噬菌体克隆在 HepG2 和 L02 上的结合活性均有差异,其中 H3 噬菌体克隆的差异性最显著. 因此,我们选择H3 噬菌体克隆对应的短肽序列 HBP3 做进一步肝癌细胞特异结合性试验. 免疫细胞化学及免疫组织化学染色结果均表明,H3 噬菌体克隆能够特异性结合于肝癌细胞,其结合位点的亚细胞定位在胞膜、核周胞质. 同时,它还能够与人肝癌组织发生特异结合,但不能与人正常肝组织结合. 此外,免疫荧光反应进一步证实了 HBP3 人工合成肽的确能够与靶细胞特异性结合. 综上所述,H3 噬菌体克隆所呈现的七肽 HBP3 能与肝癌细胞高亲合

18、性结合,但关于该短肽的生物学活性、其结合靶分子的分子基础以及其今后在抗肝癌治疗中的应用前景尚待研究. 【参考文献】 1 Du B, Qian M, Zhou ZL, et al. In vitro panning of a targeting peptide to hepatocarcinoma from a phage display peptide libraryJ. Biochem Biophys Res Commun, 2006,32(3):956-962. 2 Hu SJ, Guo XN, Xie HH, et al. Phage display selection of pepti

19、des that inhibit metastasis ability of gastric cancer cells with high livermetastatic potentialJ. Biochem Biophys Res Commun, 2006,341(4):964-972. 3 Smith GP. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surfaceJ. Science, 1985,228:1315-1317. 4 Yao VJ

20、, Ozawa MG, Trepel M, et al. Targeting pancreatic islets with phage display assisted by laser pressure catapult microdissectionJ. Am J Pathol,2005,166(2):625-636. 5 陈新华,温浩,张耀新. 噬菌体随机肽库的应用现状J. 国外医学寄生虫病分册, 2003,30(2):51-55. 6 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 金冬雁,黎孟枫译. 分子克隆实验指南M. 2 版.北京:科学出版社,1992:2

21、01-236. 7 Newton JR, Kellyy KA, Mahmoody U, et al. In vivo selection of phage for the optical imaging of PC3 human prostate carcinoma in miceJ. Neoplasia,2006,8(9):772-780. 8 Shimizu M, Saltoh Y, Itoh H, et al. Immunohistochemical staining of Ha2ras oncogene product in normal, benign and malignant h

22、uman pancreatic tissuesJ . Hum Pathol,1990,21(6):607. 9 Kaplan DE, Reddy KR. Rising incidence of hepatocellular carcinoma: The role of hepatitis B and C; the impact on transplantation and outcomesJ. Clin Liver Dis, 2003,7:683-714. 10 Zhang QQ, Song SX, Xu XM, et al. An in vitro model of tumor microvessel based on coculture systemJ. Tumori, 2004,24:226-229.

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