1、丝裂霉素 C 对兔角膜准分子激光切削术后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子 2 表达的影响作者：张磊 王强 雷宁玉 任莉 戴慧琴 【摘要】 目的 探讨丝裂霉素 C（MMC）对兔角膜准分子激光切削术（PRK）后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子 2（TGF2 ）表达的影响。方法 24 只健康新西兰白兔（48 眼）分两组行 PRK 手术，术后将浸有 0.02% MMC 的滤纸片放置在右眼角膜中央切削区（MMC 组） ，将浸有平衡盐水（BSS）的滤纸片放置在左眼角膜中央切削区（BSS 组）2 min 后用 150 ml BSS 冲洗。同时设立正常对照组。观察角膜上皮愈合情况、角膜浅基质层角膜
2、细胞数量和形态变化及角膜上皮下混浊；免疫组化检测正常对照组及手术组（MMC 组和 BSS 组）术后 1 d、1 周、4 周和12 周 TGF2 表达情况并作分析。结果 MMC 组角膜上皮愈合时间为（3.00.69）d，对照 BSS 组为（3.00.71）d，两组差异无统计学意义（P0.05） ；术后 MMC 组浅基质层内角膜细胞明显减少，两组差异有统计学意义（P0.05） ；BSS 组角膜上皮下混浊明显重于 MMC 组，两组差异有统计学意义（P0.05） ；术后各时段 BSS 组 TGF2 表达多于 MMC组。结论 MMC 不会延长角膜上皮的修复时间，并减轻术后角膜上皮下的混浊；MMC 减轻术
3、后角膜上皮下混浊形成可能部分与其调节 TGF2 的表达有关。 【关键词】 准分子激光屈光性角膜切削术；丝裂霉素 C；角膜上皮下混浊；转化生长因子 2 【Abstract】 Objective To investigate the effect of mitomycin C corneal wound healing，haze and expression of transforming growth factor2 after photorefractive keratectomy(PRK) in rabbits.Methods Twentyfour New Zealand rabbits d
4、ivided randomly into MMC group and BSS group underwent bilateral 193 nm excimer laser photorefractive keratectomy to correct 6.0 diopter of myopia. After surgery a filter soaked with 0.02%MMC was placed on the central ablation stromal bed in the right eye and BSS in the left eye for 2 minutes then i
5、rrigated with 150 ml BSS. The process of epithelialization was observed .Corneal haze was assessed biomicroscopically using Fantes scale. The number of superficial stromal keratocytes was counted and morphologic changes were observed. Expression of TGF2 was detected and analyzed by immunocytochemica
6、l method at 1 d,1 week,4 week and 12 week after surgery.Results Mean epithelialization time was （3.00.69）days in the MMC eyes and 3.00.71 days in the control BSS eyes(not statistically significant,P0.05).A remarkable reduction of keratocytes in the superficial stroma after surgery was observed in MM
7、C group(P0.05).Corneal haze was more severe in BSS group than in MMC group. Expression of TGF2 in corneas had increased more in BSS group than in MMC group at all time.Conclusion MMC did not delay epithelialization and could lessen the development of haze after photorefractive keratectomy. The effec
8、t of MMC on inhibiting haze induced by PRK maybe mediated through the suppression of TGF2. 【Key words】 photorefractive keratectomy,mitomycin C,haze,transforming growth factor2 准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy, PRK）是一种简单、安全和有效的治疗近视、远视和散光等屈光不正的方法， 。但其在角膜愈合过程中产生显著的角膜上皮下混浊(haze)和屈光回退，从而限制了该术式的进一步应
9、用 。准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomilensis, LASIK）与 PRK 相比，具有术后反应轻，视力恢复快，屈光状态稳定，无 haze，无明显疼痛等优势，成为世界的主流术式 。然而，LASIK 同样也存在着不可避免的与角膜瓣相关的术后并发症以及继发性圆锥角膜，严重威胁眼的屈光功能和眼的完整性 。所以，近年来激光表面切削术重新得到重视，并针对如何利用丝裂霉素 C（mitomycin C,MMC）减轻术后 haze 及屈光回退展开了深入的研究，并取得了理想的成果 。但 MMC 如何抑制 haze的形成，其机制仍然不明 。本研究旨在观察 MMC 对兔角膜 P
10、RK 术后角膜愈合和 haze 产生的影响，并利用免疫组化的方法，通过分析转化生长因子 2（TGF2 ）和角膜细胞变化关系，探讨 MMC 抑制角膜 haze可能机制，为在临床中更好的利用 MMC 提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物：选择国际标准实验动物纯种新西兰大白兔 27 只（滨州医学院动物实验中心提供） ，雌雄不限，体质量 2.53.0 kg，裂隙灯检查无眼前部病变。 1.1.2 主要试剂和仪器：MMC 2 mg/支，浙江海正药业股份公司生产；DME 培养液（美国 Gibco 公司） ；甘油（上海化学试剂二厂） ；TGF2 多克隆抗体（美国 Promega
11、公司） ；羊血清、生物素化抗兔 IgG 、链霉亲和素 生物素 过氧化酶复合物（美国 Maxim Biotech 公司） ；DBA（上海化学试剂二厂） ；Scan2000 型准分子激光治疗仪（美国雷塞公司） 。 1.2 方法 1.2.1 实验分组:24 只兔 48 眼，右眼为 MMC 治疗组（MMC 组） ，左眼为平衡盐水（BSS）对照组（BSS 组） ，另设 3 只兔 6 眼为正常对照组。 1.2.2 动物模型的建立:10%水合氯醛 3 ml/kg 体重腹腔注射麻醉动物，同时 0.4%盐酸奥布卡因眼表面麻醉。由专人手术。校正-6.0 D，直径 5 mm，深度约为 100 m。术后分别将直径 6
12、 mm 浸有 0.02%MMC 及 BSS的滤纸放置在右眼或左眼中央切削区 2 min，然后立即用 150 ml BSS 冲洗，涂红霉素眼膏并遮盖双眼，待动物苏醒后去掉遮盖。双眼均给予氧氟沙星点眼，每天 1 次，直至上皮愈合。 1.2.3 活体裂隙灯显微镜观察:手术组所有兔眼术后 1 d、1 周、4周、12 周检查角膜情况，记录手术组兔眼术后角膜上皮完全愈合时间；记录兔眼术后 1 周、4 周、12 周 haze 程度及分级。 haze 分级（fantes分级） 0 级：角膜完全透明；1 级：仅在裂隙灯显微镜下仔细检查方能发现的细微混浊；2 级：在裂隙灯显微镜下较易发现的细微混浊；3 级：中度混
13、浊，通过混浊的角膜看不清虹膜的细节；4 级：重度混浊，角膜混浊遮挡眼内的结构。 1.2.4 标本制作 1.2.4.1 角膜切片标本制作:分别于手术后 4 h、1 周、4 周和 12 周采集动物角膜，常规包埋切片，备 HE 染色及免疫组织化学染色。 1.2.4.2 HE 染色:在 300 倍光学显微镜下，对手数组和对照组选取角膜中央手术区仅靠上皮下 1/4 基质，测定基质浅层成纤维细胞数量。每份标本取 3 张切片，每张切片取 5 个测定区，计算平均值，结果以xs 表示。 1.2.4.3 免疫组织化学染色步骤：将标本常规脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化酶活性，正常山羊血清封闭。加一抗为 140
14、0 稀释的TGF2 单抗 50 l。加二抗：取出切片后，室温放置 20 min，0.1 mol/L PBS 洗 5 min，共 3 次，加二抗 50 l，室温孵育 10 min，0.1 mol/L PBS 洗 5 min 共 3 次。加链霉素抗生物蛋白 过氧化酶溶液，滴加三抗，室温孵育 10 min，0.1 mol/L PBS 洗 5 min，共 3 次。DBA 显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。阴性对照采用 PBS 代替一抗。免疫组织化学染色结果判定：以胞质出现棕黄色染色为阳性。 1.3 统计方法 应用 SPSS13.0 统计软件处理。秩和检验计算 haze程度比较
15、、角膜上皮愈合时间，t 检验用于免疫组化分析。 2 结果 2.1 裂隙灯显微镜观察 2.1.1 角膜上皮愈合情况:两组角膜愈合时间相似，见表 1。MMC 组平均愈合时间为（3.00.69）d（范围 24 d） ，对照 BSS 组为（3.00.71）d（范围 24 d） ，两组差异无统计学意义（P0.05） 。表 1 各组角膜上皮愈合时间分布 2.1.2 haze 情况:两组均于术后 1 周左右出现 haze，至 4 周时达到高峰，以后逐渐减退。术后 4 周与术后 1 周、12 周进行组内比较，差异有统计学意义；两组术后各时间段内 haze 分级分布比较，除 1 周时两组haze 程度差异无统计
16、学差异外（P0.05） ，其余时间段差异均有统计学意义。见表 2。表 2 Haze 等级分布表 2.1.3 光镜检查基质角膜细胞数量 正常对照组角膜浅层 1/4 基质细胞数目为（89.38.6）个。术后 1 d，MMC 组和 BSS 组浅层角膜细胞较正常对照组均下降，且 MMC 组下降较 BSS 组明显，两组差异具有统计学意义（P0.05） ；术后 1 周，MMC 组和 BSS 组浅层角膜基质细胞均较术后 1 d 时增多，但仍低于正常对照组，MMC 组角膜基质细胞数量低于 BSS组，两组差异具有统计学意义（P0.05） ；术后 4 周，BSS 组角膜基质细胞数目继续增多，并超过正常对照组，两组
17、差异具有统计学意义（P0.05） ，MMC 组增长不明显，仍低于正常对照组，与 BSS 组的差异具有统计学意义（P0.05） ；术后 12 周，MMC 组角膜基质细胞数目轻度增多，仍低于正常对照组，BSS 组角膜基质细胞数目减少，基本与正常对照相等，MMC 组与 BSS 组差异仍具有统计学意义（P0.05） ，见表 3。表 3 BSS 组、MMC 组术后不同时间角膜前 1/4 基质内平均细胞数量对比 2.1.4 免疫组化结果 免疫组化染色发现正常对照组角膜上皮及基质内角膜细胞均有极少量 TGF2 表达；术后 4 h，BSS 组、MMC 组均见TGF2 表达增多；术后 1 周，BSS 组、MMC
18、 组均见 TGF2 表达较术后 4 h 增多，BSS 组表达较 MMC 组表达强烈；术后 4 周，BSS 组TGF2 无明显变化，MMC 组表达较 1 周时轻度降低；术后 12 周，BSS组 TGF2 同术后 4 周，MMC 组 TGF2 表达再次降低，见图 1。 3 讨论 虽然 LASIK 目前仍为角膜屈光手术的主流术式 ，但由于角膜瓣所引起的并发症以及继发性圆锥角膜严重威胁眼的屈光功能和眼的完整性，以及不能应用于较薄的角膜10 ，使得角膜表面切削术得到再次重视。PRK 是准分子激光角膜表面切削术的一种，是一种简单、安全和有效的治疗近视、远视和散光等屈光不正的方法， ，但其最大的劣势在于产生
19、 haze 和屈光回退，在治疗高度近视患者时更加明显11 。已有研究表明在 PRK 术中应用 MMC 可以有效预防 haze 的发生68 。 MMC 是一种化疗药物，利用其可以调控瘢痕形成的作用，已广泛应用于青光眼滤过手术、翼状胬肉切除以及结膜、角膜上皮瘤的治疗， 。其药理作用为通过抑制胸苷酸合成酶及与 DNA 双链交叉联结来阻碍 DNA 复制及 RNA 和胶原蛋白的合成，还可使 DNA 解聚。所以，可以抑制角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞、结膜细胞以及 Tenon 囊纤维细胞的增殖 。 由于 MMC 具有细胞毒性，可以抑制角膜上皮细胞的增殖，有可能对PRK 术后上皮的修复造成影响。本研究结果
20、表明，与 BSS 组相比，MMC 组的角膜上皮修复没有延迟，与有关报道一致 。所以 MMC 对于角膜上皮的生长是安全的。 已有研究表明在 PRK 术中应用 MMC 可以有效预防 haze 的发生 。Taeim 等在实验中观察到，术后早期，MMC 组和对照组表现出相同程度的轻度 haze，6 周以后，对照组出现明显的haze，而 MMC 组 haze 仍旧较轻，12 周对照组的 haze 情况仍较严重，而MMC 组 haze 几乎消失。此结果与本研究基本一致。本研究中，术后 1 周MMC 组和 BSS 组 haze 程度基本一致，差异无统计学意义；术后 4 周，BSS组 haze 明显加重，MM
21、C 组 haze 轻度加重，差异具有统计学意义；12 周时 BSS 组 haze 仍然较重，MMC 组 haze 已经减轻，差异具有统计学意义。在另一项研究中，Taeim 等利用紫外线照射 PRK 后角膜基质床的方法探索 MMC 对 haze 的抑制作用。紫外线可以穿透整个角膜，加重角膜基质的损害，延长角膜愈合的时间以及引发更严重的 haze。结果发现，MMC 可以很好的抑制 haze 的形成，同对照组相比，效果相当明显。总之，在 PRK 术中应用 MMC 确实可以有效预防 haze 的形成。 但 MMC 如何抑制 haze 的形成，其机制仍然不明 。随着角膜上皮的刮除，角膜细胞的调亡启动了角
22、膜修复的过程 。凋亡细胞激活周围的角膜细胞，使其增殖，填充到前基质层，在这个过程中，激活的角膜细胞可以转化为成纤维细胞和成肌纤维细胞 。而成肌纤维细胞是影响角膜透明性的主要决定因素，也就是 haze 的影响因素。有研究表明 MMC 通过诱导角膜细胞凋亡减少 PRK 术后角膜细胞的数量来减轻haze 和瘢痕的形成 。本研究表明，MMC 组确实减少了 PRK 术后角膜细胞的数量，与 BSS 组相比，12 周时仍少于正常。Taeim 等在实验中同样观察到角膜细胞数量的显著减少。通过 DAP 染色，Taeim 等发现 PRK 术后 2 周，MMC 组出现严重的细胞凋亡，但随着时间延长，凋亡细胞逐渐减少
23、，12 周时反而低于对照组。Marcelo 等也有相似的结论。这是由于 MMC 不但诱导角膜细胞凋亡，同时也诱导激活的角膜细胞凋亡引起。 已有研究表明，成肌纤维细胞的出现，是导致 haze 和屈光回退的主要因素， 。而 TGF2 是促使角膜细胞分化为成肌纤维细胞的主要因素 。成肌纤维细胞表达 激动蛋白(SMA) ，可以将其进行化学标记，来证明成肌纤维细胞的存在。Taeim 用此方法在研究 PRK 后角膜成肌纤维细胞的表达中发现，术后 3 周，所有手术后角膜均出现 SMA 阳性细胞，未用 MMC 的对照组出现最多，全部位于上皮下和浅基质层中。术后 12 周，对照组角膜后部基质中也出现SMA 阳性
24、细胞，而 MMC 组角膜后部基质没有出现，对照组 SMA 阳性细胞远远多于 MMC 组，且 SMA 阳性细胞数目与 haze 的严重程度成正相关。Sonal 等在利用 RTPCR 研究 PRK 术后多种因子在角膜基质中的表达时发现，TGF2 的 mRNA 的变化最大。正常角膜仅有少量的 TGF2mRNA 表达，但在术后 21 d，TGF2 mRNA 表达比基线数量增加 300 倍，此后有所下降，但在 90 d 时，表达仍然高于基线水平。TGF2 受体 mRNA 表达情况与 TGF2 mRNA 表达相似。说明TGF2 在 PRK 术后角膜的修复过程中发挥着重要作用。以上研究结果也验证了本研究 T
25、GF2 免疫组化的发现。通过染色结果很清楚的看到，BSS 组中 TGF2 在术后 1 周大量表达，较 MMC 组表达强烈；术后 4 周，BSS 组 TGF2 无明显变化，MMC 组表达较 1 周时轻度降低；术后 12 周，BSS 组 TGF2 同术后 4 周，MMC 组 TGF2 表达再次降低。与TGF2 mRNA 的变化相一致。所以 MMC 抑制 haze 的机制之一可能为：MMC 抑制了 TGF2 的表达，继而减少了角膜细胞转化为肌成纤维细胞的可能，使肌成纤维细胞数目降低，从而 haze 减轻。 但 MMC 怎样抑制了 TGF2 的表达，是诱导角膜细胞凋亡引起，还是其他途径，需要进一步研究
26、。MMC 的毒性作用，如导致角膜内皮细胞的凋亡，过高的浓度和作用时间会使培养的人角膜细胞死亡等已有报道，所以怎样选择合适浓度的 MMC 以及作用的时长是我们需要考虑的问题。并且还需要进一步研究 MMC 对角膜的生物作用，理解其全部机制，有助于选择更佳的手段预防 haze 的产生，使准分子激光表面切削术成为完美的术式。 【参考文献】 Netto MV, Wilson SE. Indications for excimer laser surface ablation.J Refract Surg，2005，21:734741. 2 Rajan MS, Jaycock P, OBrart D,et al. A longterm study of photorefractive keratectomy 12year followup . Ophthalmology，2004，111:18131824.
