1、稳定表达 Bcl2 蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定作者：杨连君，王文亮，司晓辉 【关键词】 基因 关键词 :基因，bcl-2;癌，肝细胞;转染;基因表达 摘 要:目的 为了探讨抗凋亡基因 bcl-2 在肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡过程中的调节功能及其作用机制，建立稳定表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞株. 方法 提取含有人 bcl-2 基因的逆转录病毒真核表达载体pDOR-SB 质粒，用限制性内切酶 EcoR（酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定.用脂质体介导的基因转染法分别将 pDOR-SB 和 pDOR 质粒导入不表达 Bcl-2 蛋白的人肝癌细胞系 HCC-9204 细胞中，通过 G-418 筛选
2、获得转入目的基因的阳性细胞克隆.免疫细胞化学法检测 Bcl-2 蛋白的表达情况.经多次用有限稀释法连续克隆化直至获得 100%稳定表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞株. 结果 琼脂糖凝胶电泳可见 1.9kb 的 bcl-2 基因片断.免疫细胞化学检测表明转染了 pDOR-SB 的 HCC-9204 细胞大部分有 Bcl-2 蛋白的表达，而转染了 pDOR 空载体或未转染的 HCC-9204 细胞均未见 Bcl-2 蛋白表达.经过连续 3 次克隆化后转染 pDOR-SB 的 HCC-9204 细胞 100%表达 Bcl-2 蛋白. 结论 成功地获得了稳定表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞株，命名为H
3、CC-bcl2. Keywords:genes，bcl-2;carcinoma，hepatocellular;transfec-tion;gene expression Abstract:AIM A hepatocellular carcinoma（HCC）cell strain which can express Bcl-2protein stably was established to elucidate the regulating function and mechanism of anti-apoptosis gene bcl-2in the apoptotic process o
4、f HCC.METHODS The retrovirus eukaryotic expression vector pDOR-SB containing human bcl-2gene was extracted and identified by agarose gel electrophoresis after being cut with restricted endonuclease EcoR.The pDOR-SB and empty vector pDOR were introduced into a human HCC cell line HCC-9204cells，which
5、do not express Bcl-2protein，by lipo-some-mediated gene transfection method.The cell clones into which pDOR-SB or pDOR had been introduced were obtained with G-418selection.The expression of Bcl-2protein was detected using immunocytochemical method.The pDOR-SB-tranfected cells were cloned several tim
6、es continually by lim-ited dilution method until an HCC cell strain that can express Bcl-2protein at a100%positive rate was obtained.RE-SULTS Agarose gel electrophoresis demonstrated a1.9-kb bcl-2gene fragment after pDOR-SB being cut with EcoR.The immunocytochemical detection indicated that Bcl-2pro
7、-tein was expressed in most of the pDOR-SB-transfected cells，but there was no Bcl-2protein signal in the pDOR-transfect-ed or non-transfected HCC-9204cells.The pDOR-SB-trans-fected HCC-9204cells expressed Bcl-2protein at a100%pos-itive rate after being cloned for3times continually.CON-CLUSION HCC ce
8、ll strain that can express Bcl-2protein stably has been established successfully，and it is named as HCC-bcl2. 0 引言 Bcl-2 是最早在 B 细胞淋巴瘤中发现的一个抗凋亡基因.许多研究表明，bcl-2 能够抑制多种因素诱导的多种细胞的凋亡1 .虽然 Bcl-2在许多肿瘤中呈异常的高表达，但是原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）只能低表达或不表达 Bcl-22-6 .目前关于 bcl-2 基因与肝癌细胞凋亡关系的报道较少，对于 bcl-2 基因在肝癌细胞凋亡过程中是否具有调节作用尚不明确.
9、我们用基因转染技术把 bcl-2 基因转入不表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞系 HCC-9204 细胞中，建立稳定表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞株，为进一步进行 bcl-2 基因在肝癌细胞凋亡过程中作用的研究奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 插有正向 bcl-2cDNA（1.9kb）的 pDOR-SB 逆转录病毒真核表达载体为本校生物化学教研室朱峰博士惠赠.大肠杆菌菌株 HB101 为本校生物化学教研室惠宏襄博士惠赠.人肝癌细胞系 HCC-9204 为本室建立，用含100mLL-1 新生牛血清的 RPMI1640 培养液在 50mLL-1 CO2 条件下培养.Wizard Plus
10、质粒提取试剂盒、限制性内切酶 EcoR和T4DNA 连接酶购自美国 Promega 公司.DNA 片段回收和纯化试剂盒为美国Clontech 公司产品.LipofectAMINE 转染试剂盒和 G-418 为美国 Gibco 公司产品.鼠抗人 Bcl-2 单克隆抗体（mAb）为美国 Oncogene 公司产品.免疫组化 ABC 试剂盒为美国 Vector 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 pDOR-SB 载体的鉴定及 pDOR 空载体的获得 提取 pDOR-SB 质粒，经 EcoR酶切后，8gL-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.回收并纯化 6.5kb 的基因片断，经 T4DNA 连接酶连接后转化大
11、肠杆菌 HB101. 1.2.2 基因转染和细胞克隆筛选 用脂质体载体 LipofectAMINE 将 pDOR-SB 质粒转染 HCC-9204 细胞，同时设 pDOR 空载体转染对照和不转染的 HCC-9204 细胞对照.3d 后换用含G-418（500mgL-1 ）的 RPMI1640 培养液（含 100mLL-1 新生牛血清）继续培养，约 23wk 后未转染的 HCC-9204 细胞对照完全死亡，转染的细胞大多数死亡时，收集 G-418 抗性的细胞克隆，扩大培养. 1.2.3 免疫细胞化学染色 生长于盖玻片上的细胞用 950mLL-1 乙醇固定 15min.分别经 3mLL-1 H2
12、O2 和 3mLL-1 Triton X-100 处理后，加正常羊血清，37，30min.加鼠抗人 Bcl-2mAb，37，1h.加生物素化的羊抗鼠 IgG mAb，37，30min.加 ABC 复合物，37，30min.上述各步之间均以 PBS 振洗.用新鲜配制的 DAB 显色 10min.用苏木精稍微衬染.脱水，透明，封片. 1.2.4 转染细胞的有限稀释法克隆化 用胰蛋白酶消化并用培养液吹散转染细胞的 G-418 抗性克隆.准确计数细胞后，系列稀释至每毫升含 10 个细胞.加入到 96 孔培养板，100L孔 -1 .5d 后观察并计数单克隆细胞孔，并取单克隆孔细胞爬片后进行 Bcl- 2
13、mAb 的免疫细胞化学染色.连续进行多次克隆化，直至所有的单克隆孔都为 Bcl-2 染色阳性. 2 结果 2.1 pDORSB 真核表达载体的鉴定 pDOR-SB 质粒经 EcoR酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示除了 8.4kb（部分未切开的 pDOR-SB）条带以外，出现了 6.5kb（切开的 pDOR 空载体）和 1.9kb（切开的 bcl-2cDNA）的两条基因片段（Fig1）. 2.2 细胞的 G418 筛选 细胞转染后，经 G-418 持续筛选，未转染的细胞在含 G-418 的培养液中 1wk 内全部离壁死亡，2wk 时转染组的大部分细胞死亡，并可见散在生长的 G-418 抗性细胞克隆.免
14、疫细胞化学染色显示，在绝大部分转染 pDOR-SB 的细胞的胞质中可见棕色阳性信号，而转染 pDOR 空载体和未转染的 HCC-9204 细胞未见阳性染色. 2.3 转染细胞的有限稀释法克隆化 经 3 次连续克隆化后免疫细胞化学检测显示，100%单克隆孔细胞为Bcl-2 阳性（Fig2）.把反复证明为 Bcl-2 阳性的单克隆孔细胞扩大培养并冻存，命名为 HCC-bcl-2. 3 讨论 Bcl-2 蛋白定位于线粒体膜、内质网膜和核膜孔周围，能够抑制造血细胞生长因子撤销、加热、X 射线、化疗药物、癌基因 c-myc 或抑癌基因p53 等多种因素所致的细胞凋亡1 .以往研究表明，bcl-2 及其基
15、因家族其它成员在不同的肿瘤细胞凋亡中的作用有差异，说明还有其它因素参与 bcl-2 对细胞凋亡的调节过程7-9 .多数报道认为，把 bcl-2基因转染入靶细胞之后，能够抑制其凋亡的发生.但是，也有报道认为，有的情况下 bcl-2 可能并不参与细胞凋亡过程，导入 bcl-2 基因不能阻滞细胞凋亡10 .对于有些肿瘤，Bcl-2 蛋白的表达状况与肿瘤的预后也不一定相关11 .这种情况的发生机制目前还不清楚.肝癌是一种常见的恶性肿瘤12，13 .许多研究结果表明，肝癌组织只能低度表达Bcl-2 蛋白，其阳性率往往低于癌旁肝组织4-6，14 .最近有作者报道 bcl-2 能够抑制抗 Fas mAb 介
16、导的肝癌细胞凋亡15，16 .目前关于 bcl-2 基因对其它因素诱导的肝癌细胞凋亡是否具有调节功能及其作用机制尚无定论.HCC-9204 是一株对许多凋亡诱导因素敏感的肝癌细胞系，而且多次免疫细胞化学检测表明 HCC-9204 细胞不表达 Bcl-2 蛋白17 .我们选用此细胞系进行转染 bcl-2 基因以建立稳定表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞模型. 脂质体是内脂质双分子层组成的环状封闭囊泡，它可以和 DNA 形成脂类-DNA 复合物，该复合物通过内吞方式入胞，从而使基因转入细胞.脂质体介导的基因转染法，尤其是新一代产品 Lipofec-tAMINE，对于一些难转染的细胞效率很高，是目前常
17、用的一种基因转移方法18 .pDOR 是一种高效的真核表达载体，含有可表达抗氨基甙类抗生素（Ge-neticin 或 G-418）蛋白的 Neo 基因.转染后通过用 G-418 筛选，未转入目的基因的细胞死亡，可获得转染了目的基因的细胞克隆.为了得到 100%表达 Bcl-2 蛋白的肝癌细胞株，我们用有限稀释法连续进行了 3 次克隆化.免疫细胞化学染色结果表明，最终克隆出来的转染细胞 100%表达Bcl-2 蛋白.我们把 bcl-2 基因转染到不表达 Bcl-2 蛋白的 HCC-9204 肝 癌细胞中，并得到了稳定表达 Bcl-2 的肝癌细胞株 HCC-bcl2，成功地建立了表达 Bcl-2
18、的肝癌细胞模型，为进一步应用此种细胞株进行 bcl-2基因对肝癌细胞凋亡的调节及其作用机制的研究奠定了基础. 参考文献: 1Pellegrini M，Strasser A.A portrait of the Bcl-2protein family:Life，death，and the whole pictureJ.J Clin Immunol，1999;19（6）:365-377. 2Qiu XC，Zhang HZ，He DW，Yang LJ，Fan QY.Expression of bcl-2，bax and c-fos genes in the human osteosarcoma tis
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