1、戊四氮诱导发育鼠癫【关键词】 戊四 摘要 :目的 探讨戊四氮诱导发育鼠癫持续状态（SE）后海马结构的突触重建以及 NMDA 受体在其中的作用。 方法 利用图像分析仪测定戊四氮诱导的发育鼠癫持续状态模型及用 NMDA 受体拮抗剂 MK-801 治疗后海马结构内 CA3 区及齿状回内分子层突触素（p38）的阳性免疫反应产物的光密度值（A） 。 结果 不同日龄 SD 大鼠 SE 后海马结构内各部 p38阳性免疫反应产物光密度值较对照组显著增加，尤以 CA3 区苔藓纤维层和齿状回分子层内带为甚;MK-801 可显著减少 p38 的表达。 结论 癫持续状态后存在突触重建现象，一方面是癫发作的结果，另一方
2、面也可能是导致癫反复发作的分子学基础;在此过程中 NMDA 受体发挥着重要的作用。 关键词 :发育鼠;癫持续状态;突触素;齿状回;MK-801 Abstract:Objective To study the synaptic reorganization of hippocampal formation after pentylenetetrazol-induced sta-tus epilepticus in developing rats and the effect of NMDA receptor antagonist MK-801on it.Methods The optical d
3、ensity（A）of synaptophysin（p38）immunoreactive product was examined by image pattern analysis in the hippocampus of developing rats associated with pentylenetetrazol-induced status epilepticus and MK-801treatment.Results The A of p38positive im-munoreactive product in hippocmpal formation in the epile
4、ptic group was higher than that in the control，especially in the mossy fiber layer of the CA3and the inner molecular layer of the dentate gyrus.The A in MK-801group was lower significantly than in epileptic group.Conclusion The increase of p38expression（related to synaptic reorganization）may be the
5、result from the status epilepticus，as well as the molecular basis of the repeated seizures.NMDA receptors play an important role in the synaptic reorganization. Key words:developing rats;status epilepticus;synaptophysin;dentate gyrus;MK-801 癫是最常见的神经系统疾病之一，是由于脑细胞的突然放电所引起反复性惊厥发作。其中癫持续状态（status epilept
6、icus，SE）因能够造成严重的全身性和神经元的损伤而受到重视。近年来，在不同的动物癫模型及人类癫灶的形态学研究中发现了突触重建现象，被认为是癫发生后中枢神经系统可塑性变化的重要反映1 。突触素（synaptophysin，p38）系一相对分子质量为 38000 的钙结合糖蛋白，位于小突触囊泡上，在神经元胞体合成后被转运至轴突终末贮存。p38 作为突触囊泡的一种特异标志性蛋白，其密度和分布可间接反映体内突触的数量和分布情况，从而反映出突触结构和功能的变化，与突触重建密切相关2 。 许多研究表明，成年大鼠在 SE 发作后海马等结构中存在明显的突触重建现象，而本研究建立不同年龄幼鼠戊四氮（pent
7、ylenetetrazol，PTZ）致 SE 模型，采用免疫组织化学方法动态观察 p38 在发育鼠海马内的表达，并研究应用非竞争性 N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂 MK-801 对其表达的影响，以探讨发育期致动物海马突触功能、突触重构变化过程及 NMDA 受体在突触重建中的作用。 1 材料和方法 1.1 试验动物和试剂 1.1.1 实验动物 健康 SD 大鼠 7 天、14 天、21 天、28 天 4 个日龄组，雌雄不限，各组均为 54 只，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为癫持续状态组（SE 组） 、MK-801 治疗组（MK-801 组）和对照组（NS 组） ，每组各 6 只。 1.
8、1.2 试剂 鼠抗 p38 单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品;SP 免疫组化染色试剂盒，美国 ZYMED 公司产品;PTZ、MK-801 为美国Sigma 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 癫持续状态模型的建立和分组处理 各日龄大鼠的 SE 组与 MK-801 组腹腔内注射 PTZ（80mg.kg，用生理盐水稀释成 100g.L） ，发作开始时的表现按 Lado 幼鼠癫发作分级标准3 评价，均达到 3.58 级发作，呈癫持续状态，发作 1h2 组均给予地西泮腹腔内注射（10mg.kg）以终止发作，MK-801 组给地西泮同时腹腔内注射 MK-801，剂量为1mg.kg（用生理盐水
9、稀释成 0.5g.L） 。各日龄大鼠 NS 组用与 PTZ 等体积的生理盐水腹腔内注射，1h 后亦给予同剂量的地西泮腹腔注射。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和喂养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同，减少外界干扰造成的差异。 1.2.2 组织切片的制备 4 个日龄组分别于发作后第 7、14、28 天（每一时间点各组均为 6 只）腹腔内注射 10%水合氯醛（0.35ml.kg）麻醉，4%多聚甲醛左心灌注固定取脑。在海马部位做连续冠状冰冻切片，切片厚 30m，每隔 2 张取 1 张切片，每例标本（双侧海马结构）取切片不少于 8 张。 1.2.3 免疫组织化学染色 以鼠抗 p38 单克隆抗体（1
10、100）作为一抗，采用 SP 法行 p38 免疫组织化学染色，用 DAB 和 H 2 O 2 呈色，自来水冲洗，贴片，脱水，透明，封片。棕黄色着色为阳性。阴性对照试验以 PBS 代替一抗，其余染色步骤相同。 1.2.4 结果判定 p38 免疫反应产物的标记强度以光密度值（A）表示，应用 LEICA Qwin 图像处理与分析系统（德国）测定齿状回分子层内带与海马 CA3 区苔藓纤维层等部位，每个部位测定 10 个视野的 A 值（分别为A1、A2A10） ，同时测定同一张切片的胼胝体的 A 值（A 0 ）作为背景，计算出校正 A 值（CA 值）:CA=（A1+A2+A10）.10-A 0 。每例标
11、本被检各区测 6 张切片，该例标本的 p38 免疫反应产物 A 值为各片 CA的平均值。 1.3 统计学处理 所得结果以xs 表示，应用 SPSS11.5 软件进行统计学处理，采用单因素方差分析（ANOVA）进行显著性差异分析，检验水准:=0.05。 2 结果 2.1 行为学观察 SE 组与 MK-801 组大鼠注射 PTZ 后 12min 进入潜伏期，由自由活动状态逐渐转为安静、呼吸加快，很快出现癫发作，渐次出现连续点头、前肢阵挛、后退、摔倒;78 级发作的大鼠则表现为狂奔嘶叫、全身强直-阵挛性发作，同时伴有全身青紫。NS 组大鼠无行为学改变。 2.2 p38 免疫反应产物 2.2.1 NS
12、 组 NS 组切片的海马结构内 p38 免疫反应产物呈板层样分布，神经毡内免疫反应产物呈特异性点状或颗粒状沉积，多为细颗粒状沉积，神经元胞质、胶质细胞、血管及白质不被染色。在海马 CA3 区苔藓纤维层内，深染的颗粒状免疫反应产物较为均匀分布，整体呈月牙形（图 1A） 。在齿状回内分子层内带染色最深，颗粒细胞轮廓边缘也有点状反应产物沉积（图 1B） 。阴性对照实验切片无特征性免疫反应产物。各日龄组切片经分析比较，14、21 与 28 日龄鼠的 p38 的表达逐渐增加，且两两比较有显著性差异（P0.05） ，但 35、42、49、56 日龄鼠较 28 日龄鼠均无显著性差异（P0.05） 。图 2
13、示 NS 组不同日龄鼠 p38 的表达趋势。 图 1 海马结构内突触素 p38 免疫反应产物（略） A:箭头示 CA3 区苔藓纤维层（免疫组化染色，100）B:箭头示齿状回分子层内带（免疫组化染色，40） 图 2 NS 组不同日龄鼠 p38 的表达趋势（略） 2.2.2 SE 组与 MK-801 组 SE 组海马结构内 p38 免疫反应产物的分布特征无明显变化。定量结果显示，各日龄组在癫发作后各个时间点海马CA3 区苔藓纤维层、齿状回分子层内带 p38 免疫反应产物 CA 值显著增加（P0.05） ，其中均以发作后 14 天增加达最高峰。 MK-801 组齿状回分子层内带及 CA3 区苔藓纤维
14、层 p38 免疫反应产物CA 值较各日龄 SE 组各个时间点均显著降低（P0.01） ，见表 1。 表 1 3 组大鼠海马结构内 p38 免疫反应产物 CA 的比较（略） 与 NS 组比较:*P0.05，*P0.01;与 PTZ 组比较:#P0.05，#P0.01 3 讨论 目前，对癫反复发作的病因的说法很多，但颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重建已被认为是其细胞机制之一。即神经系统因癫或其他因素作用受损后，现存的神经元可通过轴突出芽形成不同的径路与原有的突触后位点或新的突触后位点发生接触，形成新的突触。同时，平时处于休眠状态的侧支和突触联系被激活，从而完成神经回路的改造和突触的重组，由
15、此导致突触可塑性发生变化。 p38 于 1985 由 Jahn 等4 从大鼠脑突触囊泡中提取，它几乎存在于所有神经终末的突触囊泡膜上，是一种重要的囊泡膜标志蛋白，参与多种突触相关活动，如参与 Ca 2+ 依赖性神经递质释放过程，并与长时程增强（long-term potentiation，LTP）的诱导与维持有关5 。免疫组织化学显示，颗粒样 p38 免疫反应产物基本上反映了被检区突触的分布和密度。经电镜证实，光镜下标记的 p38 颗粒样结构实际上就是成簇的囊泡。由于 p38 含量与突触密度呈正相关，因此借助图像分析系统测量 p38 免疫产物的平均光密度值可推测突触数量或密度，从而反映出突触结
16、构和功能的变化，并达到在光镜水平分析超微结构的目的6 。以往研究证明，正常大鼠中枢突触发育过程主要在生后 3 周内完成7 。沈丽等8 对大鼠海马突触发育可塑性进行研究发现大鼠海马 CA1 区生后 20 天至 30 天突触数目仍有所增长，说明 CA1 区突触数目增殖可持续至生后 1 个月，但 20 天突触较 30 天突触幼稚。本试验结果显示 NS 组 28 日龄幼鼠 p38 的表达较 14、21 日龄有显著性差异（P0.01） ，但比较 35、42、49、56 日龄均无显著性差异（P0.05） ，说明大鼠脑内突触的发育在 28 天左右完成。本试验发现，SE 发作可使得大鼠脑内结构，尤其是海马内
17、CA3 的苔藓纤维层和齿状回分子层内带 p38 表达显著增加。由于胶质细胞不表达 p38，因此实验所见的 p38 增加可能主要由于神经元活动所致。但是 p38 免疫活性增高的机制目前仍不十分清楚，许多研究表明癫过程中常伴有海马结构内选择性神经元丢失9 ，神经元的丢失可使下位突触空缺，存活的神经元的轴突在失去靶器官后，就会出现轴突的出芽和形成许多侧支，填补丢失神经元留下的空间，并与其他神经元建立新的突触联系，构成异常的神经网络，因此其突触前囊泡的数量可能增加，另外也可能与突触前膜功能代偿性增加有关。Chen 等10 在大鼠局部皮质注射海人酸的脑区也发现 p38 免疫组化反应增强和神经元脱失，提示
18、 p38 表达增强是神经元损伤的结果。综合既往研究，我们认为 SE 发作与 p38 表达增强之间关系可能为:癫发作后大量 Ca 2+ 内流，激活了 Ca 2+ .CaM 依赖性蛋白激酶系统，促进兴奋性氨基酸释放11 ，p38 蛋白正是 Ca 2+ .CaM 依赖性蛋白激酶 12 。惊厥后NMDA 受体活性的增高，谷氨酸过量释放后，一方面介导兴奋毒性损害，导致神经元坏死或凋亡;另一方面也启动了一些神营养因子的表达，特别是脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达，而 p38 是 BDNF 酪氨酸激酶级联反应通路的下游应答分子，从而在突
19、触可塑性及其突触功能发挥中有重要作用。袁宝强等13 研究发现，以 c-fos 为代表的即刻早基因（IEGs）在惊厥发作后其 mRNA 在海马等部位表达增强。Smeyne 等14 亦研究发现，海人酸大鼠腹腔注射后 c-fos mRNA 在海马的表达增强，反映了神经元胞体对突起再生的调控。c-fos 作为核内第三信使，参与启动和调控系列靶基因的表达，而 p38 基因是受 IEGs 调控的靶基因之一15 。因此，p38 蛋白表达增强可能与IEGs 表达调控有关。我们前期工作已观察到单次惊厥发作后海马区神经元细胞核中细胞核因子 B（NF-B）表达明显增加，且可能诱导了神经细胞的凋亡。NF-B 作为多极
20、基因调控蛋白，可调控神经突触重组的过程16 ，它在静息状态下位于细胞质中，SE 发作后 NF-B 被激活，转位入核，参与神经元的激活过程，进而调节突触活动。 本试验发现，SE 发作后 p38 免疫反应产物的增加一直持续到试验终点 28 天，推测海马 p38 免疫反应产物增加，一方面是癫发作的结果，另一方面也可能是癫慢性反复发作的分子病理学基础。考虑由于当出芽侧支回返时，可穿过颗粒细胞层到达齿状回分子层或穿过 CA3 锥体细胞层到达 CA3 始层形成突触联系，海马结构的突触调整，构成了密乱的反复兴奋环路，激动信号在环路中不断振荡，自我放大和增强，可导致癫反复发作。NMDA 受体是广泛分布于中枢神
21、经系统的谷氨酸敏感离子通道受体，在癫的发生、发展和维持中起着重要的作用。它是一种具有许多不同变构调控位点并对 Ca 2+ 高度通透的配体门控离子通道，它不仅通过调节钙离子内流，保持神经元正常的生理功能，同时与中枢神经系统的发育、可塑性密切相关，并参与缺氧缺血性脑损伤、癫和大脑退行性变等损伤的病理生理过程17 。MK-801 是一个强有力、非竞争性的NMDA 型受体拮抗剂，富亲脂性，易于通过血脑屏障，能有效地、选择性地作用于具有此受体的海马神经细胞，而且 NMDA 受体上 MK-801 非竞争性拮抗部位在不成熟大鼠比成年大鼠敏感18 。MK-801 结合于与受体耦联的离子通道内部，从而阻断 Ca
22、 2+ 内流，减轻 Ca 2+ 超载，减少神经元的损伤，保护神经细胞，从而减少癫后神经发生与突触重建。本实验对不同日龄组的幼鼠应用 MK-801 后发现 p38 的表达在各个日龄组各个时间点较 PTZ 组均显著降低（P0.01） ，说明 NMDA 受体在 p38 的表达中起着重要的作用。 本实验动态观察了 PTZ 致癫持续状态后海马突触素的改变，结果说明在生理状态下 SD 大鼠脑内 p38 在生后 28 天即达高峰;而 SE 发作后突触素表达显著增强，提示 SE 发作后海马等结构内存在神经元的突触重建现象，因而这些结构的神经可塑性发生改变，并由此可能导致神经生理功能的改变，继而可能成为癫反复发作的解剖基础。
