1、携带人白细胞介素 18 基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定作者：毛立军，郑骏年，郑典宝，郝林，郑宏祥，裴东生 【关键词】 白细胞 摘要 :目的 构建人白细胞介素 18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。 方法 以质粒 pJWIL-18 为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得 IL-18 基因片段，酶切后克隆至pCA13 质粒，构建重组质粒 pCA13IL-18。鉴定正确后，将 pCA13IL-18 与含有腺病毒右臂的质粒 pBHGE3 共转染 HEK293 细胞，912 天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的 DNA，进行 PCR 鉴定。大量扩增后，
2、氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。 结果 酶切分析、序列测定、PCR 验证表明，IL-18 基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。 结论 成功构建了表达人 IL-18 基因的复制缺陷性腺病毒载体。 关键词 :白细胞介素 18;腺病毒载体 Abstract:Objective To construct the replication-deficient recombinant adenoviruses vector expressing IL-18gene.Methods To get human IL-18template DNA sequences，one pair of specifi
3、c primers to human IL-18gene were designed and synthesized and used to amplify IL-18cDNA by polymerase chain reaction（PCR）using pJWIL-18as the template.The PCR product was digested with EcoRand BamHand inserted into plasmid pCA13to construct the recombinant plasmid pCA13IL-18，which was then identifi
4、ed and was cotransfected together with pBHGE3into HEK293cells，where the viral plaques appeared9-12days later.The recombined adenoviruses were verified，purified，propagated on HEK293cells，and purified by CsCI gradient according to standard techniques.Finally，the functional PFU titers were determined b
5、y plaque assay on HEK293cells.Results The evidences of endonuclease digestion，DNA sequencing and PCR analysis confirmed that human IL-18gene was correctly inserted into the replication-deficient recombinant adenoviruses vector.Conclusion Recombinant adenoviruses vector expressing human IL-18gene has
6、 been successfully constructed as a potentially useful tool for investigating the anti-tumor role of IL-18. Key words:interleukin-18;adenovirus vector 白细胞介素 18（IL-18）又称干扰素- 诱导因子（interferon-inducing factor，IGIF） ，是 Okamura 等1 在中毒性休克小鼠肝脏中克隆到的一种蛋白。IL-18 通过诱导干扰素（IFN）产生、增强自然杀伤细胞（NK 细胞）和细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）活性
7、、诱导 Th1 细胞分化增殖、抑制肿瘤血管生成等多种生物学功能，发挥其抗肿瘤作用2 。复制缺陷型腺病毒载体以其高安全性，而成为目前肿瘤基因治疗研究中应用最多的载体。我们通过构建表达人 IL-18 基因的复制缺陷型腺病毒载体，以期为进一步将 IL-18 应用于抗肿瘤研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 菌株、细胞和质粒 感受态大肠杆菌 JM101 由徐州医学院生物化学教研室保存，pJWIL-18 质粒由徐州医学院生物化学教研室裴冬生老师惠赠，HEK293 细胞、pCA13 质粒、pBHGE3 质粒由中国科学院生物化学和细胞研究所刘新垣院士惠赠。 1.1.2 主要试剂 各
8、种常规限制性内切酶、T 4 DNA 连接酶、DNA 提取试剂盒、PCR 试剂盒、DNA 回收纯化试剂盒为美国 Promega 公司产品。Effectence 转染试剂盒、QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒为德国 Qia-gene 公司产品。 1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成 参照 GenBank 中的人 IL-18 基因序列，设计上游引物 P1 和下游引物 P2，序列如下（下划线处为引入EcoR、BamH的酶切位点）:P1 为 5-TGTGAATTCTACTTTGGCAAACTTG-3，P2 为 5-TGTGGATCCAAGCTTTAGTCTTC-3。PCR 条件:94
9、7min，941min，571min，721min，30 个循环，72延伸 5min。反应产物经 EcoR、BamH酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收 IL-18 基因。 1.2.2 pCA13IL-18 载体的构建、鉴定 pCA13 质粒含有 5 型腺病毒序列 225790bp，但在缺失的 E1 区（3423523bp）插入了人 HCMV 启动子（-299+72）及 SV40poly A 加尾信号，在启动子和加尾信号之间含有多个多克隆位点。用 BamH和 EcoR酶切 pCA13 质粒，回收质粒 DNA 大片段。将 PCR 产物酶切后回收的 IL-18 基因用 T 4 DNA 连接酶将其定向克隆至
10、pCA13 质粒 IE 启动子之后，构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌 JM101 感受态细胞，筛选氨苄青霉素抗性克隆，命名为 pCA13IL-18。小量扩增、酶切鉴定、DNA 序列分析（Invitrogen 公司，上海） ，测序证实后，大量扩增备用。 1.2.3 表达 IL-18 基因复制缺陷型重组腺病毒载体的构建 采用Effectence 介导的细胞内质粒 DNA 同源重组法构建。pCA13IL-186g 和pBHGE33g 混合均匀后，加 Buffer E 至 450l，再加入Enhancer24l，室温下静置 5min 后加入 75l Effect-ence，室温下静置 10min
11、 后加入 3ml 培养液，混合均匀后立即平均加到已经更换新鲜培养液的含 HEK293 细胞的 6 孔细胞培养板中，6h 后更换新鲜培养液。继续培养 912 天，23 天后更换 1 次培养基。当出现明显细胞病变效应（CPE）时，回收细胞，-70保存。所得病毒命名为 Ad-IL-18。 1.2.4 病毒 Ad-IL-18 的 PCR 鉴定 抽提病毒 DNA 当作模板进行 PCR，分别检测重组腺病毒中是 否插入目的基因和 E1 区是否缺失。鉴定目的基因的上游引物为 5-TCGTTTAGTGAACCGTCAGATC-3，下游引物为 5-ACACGGTCTCGTAGGTCAAG-3，PCR 条件:945
12、min，941min，5630s，721min，30 个循环，72延伸 5min。鉴定 E1 区的上游引物为5-CGCGGGAAAACTGAATAAGAG-3，下游引物为 5-ACCGCCAACATTACAGAGTCG-3，PCR 条件:943min，941min，5745s，721min，30 个循环，72延伸 5min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析。 1.2.5 Ad-IL-18 大量制备与纯化 将 HEK293 细胞铺于 3040 个10cm dish，至细胞长满，每板加入病毒 50l。待细胞全部病变后（47 天） ，每块板中加入 500l10%Nonidet P40（NP40）裂解细胞
13、。收集整个细胞裂解物，12000r.min 离心 10min，弃细胞碎片，收集上清。加入 PEG8000 冰上 1h 沉淀大量扩增的 Ad-IL-18 病毒，氯化铯（CsCl）梯度离心（20000r.min，2h） 。收集密度为 1.301.40kg.L 病毒条带至透析袋中，4透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。1.2.6 腺病毒滴度测定 将病毒原液依次稀释为原液的 10 倍，稀释后的梯度浓度为 10 -6 10 -12 ，将 7 个稀释液加入 24 孔板，每孔0.4ml。培养 10 天后显微镜下观察出现空斑的孔数。病毒滴度（PFU.ml）=（最大稀释病毒液感染形成的空斑数稀释
14、倍数）.0.4ml。 2 结果 2.1 pCA13IL-18 的鉴定 重组质粒用 EcoR、BamH双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱上，可见一大小约 1100bp 的 DNA 片段，与目的基因大小一致。测序证实与设计的 IL-18 转录模板序列相同（图 1） ，表明pCA13IL-18 中已含有 IL-18 模板 DNA 片段。 2.2 Ad-IL-18 鉴定和滴度测定 以病毒 DNA 为模板进行 PCR，反应产物经琼脂糖凝胶电泳可观察到在约 1100bp 的位置上有一条带，表明Ad-IL-18 含有目的基因（图 2） 。Ad-IL-18 在 540bp 的位置没有条带，而野生型的腺病毒有一条明显
15、的条带，证明 Ad-IL-18 是 E1 区缺失的复制缺陷型重组腺病毒。说明 Ad-IL-18 载体构建成功（图 3） 。 腺病毒滴度根据计算公式为 110 11 PFU.ml。 图 1 pCA13IL-18 测序图（略） 图 2 PCR 鉴定目的基因的电泳图（略） 1.Ad-IL-18 2.阴性对照 M.DL2000Marker 图 3 PCR 鉴定 E1 区电泳图 （略） 1.阳性对照 2.阴性对照 3.AD-IL-18 M.DL2000Marker 3 讨论 IL-18 是一种重要的免疫调节因子3 ，可诱导 Th1 细胞产生IFN-，与 IL-12 有协同作用，但两者诱导机制不同，其诱导
16、 IFN- 产生的能力比 IL-12 强，可以直接激活 IFN- 的启动子4 。IL-18 可直接激活 NF-B 起到促进干扰素基因转录的作用，同时促进 T 细胞增殖，加强 FasL 介导的 NK 细胞的细胞毒作用，此外还有抗血管生成作用，因此在抗肿瘤和抗微生物感染方面有着广泛的应用前景5 。 在质粒载体介导的基因转移和病毒载体介导的基因转移系统中，病毒载体因不易被降解，其表达目的基因更为高效。复制缺陷型腺病毒为E1 基因缺失的腺病毒，是一种高效的基因转移载体系统，它不仅能感染分裂期细胞，而且可感染静止期细胞，感染率高。同时腺病毒 DNA 不与宿主基因组整合，插入的外源基因也相当稳定，因此腺病
17、毒载体安全性高，已经成为目前基因治疗中最常用的载体而被广泛用于基因治疗研究和临床试验。 本研究成功构建了表达 IL-18 的复制缺陷型腺病毒载体，为体内外尝试对多种肿瘤细胞和组织进行基因功能研究及基因治疗提供了有利的工具。 参考文献 : 1 Okamura H，Tsutsi H，Komatsu T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells J.Nature，1995，378（6552）:88-91. 2 Mojtahedi Z.Interleukin（IL）-18may enhanc
18、e Th1response in early cancer but aggravate malignant disease in its later stagesJ.Med Hy-potheses，2005，65（5）:995-996. 3 Mee JB，Alam Y，Groves RW.Human keratinocytes constitutively pro-duce but do not process interleukin-18J.Br J Dermatol，2000，143（2）:330-336. 4 何 龙，章卫平，曹雪涛.小鼠白细胞介素 18 的基因克隆及其融合蛋白的表达J.中国免疫学杂志，1998，14（4）:239-242. 5 Vankayalapati R，Wizel B，Weis SE.Production of interleukin-18in human tuberculosisJ.J Infect Dis，2000，182（1）:234-239.
