1、戊四氮诱导单次惊厥幼鼠海马碱性成纤维细胞生长因子表达的研究【摘要】 目的 利用戊四氮单次惊厥幼鼠模型，研究癫疒间单次惊厥发作后海马各区碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达情况。方法 建立戊四氮腹腔注射幼鼠单次惊厥发作模型，分成 A 组（癫疒间发作组）和 B组(生理盐水对照组） 。每个组后按造模后 1 天、7 天、14 天分为 3 组。HE 染色观察病理形态改变，免疫组化观察海马 bFGF 表达变化。结果 病理形态上 A 组可见海马神经元变性、坏死，胶质细胞增生，B 组形态学无明显变化。 bFGF 表达：A 组发作后 1 天 bFGF 表达增高最明显(P0.01)，以 CA1 区和齿状回明显，
2、以后逐渐下降，7 天时仍高于 B组(P0.05)，14 天时下降到较低水平，和 B 组无显著性差异(P0.05)。B 组各时间点 bFGF 表达无显著性差异。 结论 幼鼠单次惊厥发作后海马 bFGF 表达增加，在发作后 7 天内较为明显。bFGF 在癫疒间后脑损伤的自我修复中可能发挥着重要的作用。 【关键词】 癫疒间 碱性成纤维细胞生长因子 海马 Abstract： Objective To study the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in the hippocampus of epileptic pedo-rat
3、s at different time points and investigate its bearing on epilepsy. Methods Forty-two 14-day old SD pedo-rats were randomly divided into two groups: A (epilepsy model group) and B (normal saline group). Pentetrazole was used to induce seizure models. The expression of bFGF in the hippocampus of rats
4、 was studied by immunofluorescent labeling technique. H-E staining was done for pathomorphological study. Results In group A， neuronal degeneration and necrosis in the hippocampus， and cellular proliferation of glial cells as well， were noticed; the expression of bFGF was increased， most marked 1 da
5、y after seizure (P0.01)， continued to be higher for 7 days (P0.05)， and then declined and approached the control level 14 days later (P0.05). Conclusion The expression of bFGF in hippocampus of 14-day rat is increased after acute epilepsy， significantly higher for 7 days after seizure. bFGF may play
6、 an important role in the self-plerosis after brain injury induced by epilepsy in pedo-rats. Key words: epilepsy; basic fibroblast growth factor; hippocampus 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种具有多种生物活性的神经营养因子，广泛存在于外周及中枢神经系统内， 它在大脑皮质、海马、纹状体、小脑等多种组织均有表达，对神经元和胶质细胞有明显的营养和保护作用，能够维持中枢神经系统的
7、正常功能。在中枢神经系统遭受损伤后，神经胶质细胞和神经元高度表达bFGF，以维持神经元的存活和促进损伤神经元的修复1-2 。癫疒间发作也能诱导内源性 bFGF 在选择性脑区表达增高3 ，但不同发作类型表达特点并不相同。临床上儿童癫疒间发病率远高于成人，但现有文献很少涉及发育大鼠癫疒间后大脑 bFGF 表达情况。本文主要研究幼鼠单次惊厥后各时间点 bFGF 在海马的表达分布情况，初步探讨 bFGF 和未成熟脑癫疒间的关系。 1 资料和方法 1.1 动物及分组 42 只 14 天 SD 大鼠，雌雄不限，体重 2538 g，随机分为:A 组:癫疒间发作组(n=24)和 B 组:生理盐水对照组(n=1
8、8)， 每个组按造模后 1 天、7 天、14 天分为 3 组，A 组每个时间点 n=8，B 组每个时间点 n=6。 1.2 癫疒间动物模型的建立 A 组给予大鼠腹腔注射戊四氮 60 mg/kg，逐个动物观察记录，行为分级标准依据 Racine 分级标准4分为 5 级。选择 V 级单次发作者（发作不超过 30 min）作为癫疒间研究模型。B 组同时给予等体积生理盐水腹腔注射。 1.3 灌注和取材 10%水合氯醛(0.35 ml/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后剪开胸腹腔，暴露心脏和肝脏，用灌注针自心尖向上 45 度进针至主动脉起始段，剪破右心耳，先快速灌注生理盐水，接着用 4%多聚甲醛先快速滴注，
9、然后缓慢滴注直至大鼠四肢强直，肝脏变白后停止灌注，拔出穿刺针，剪开颅骨，取嗅脑至中脑之间的脑组织，放入 4%多聚甲醛固定 12 h 以上，然后进行石蜡包埋，切片取海马组织冠状位片，片厚67 m，每只大鼠取不连续部位脑片 810 张，分别进行 HE 染色和免疫组化观察。 1.4 免疫组化 采用两步法免疫组化方法，试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，一抗为 1100 兔抗大鼠 bFGF 多克隆抗体，阴性对照用 PBS取代一抗，显色剂用 DAB 和 H2O2 进行着色，操作步骤按试剂盒操作说明书进行，阳性细胞被染成棕褐色。 1.5 图像分析及统计学处理 切片置于 Olympus PM-CB 显微镜下观察
10、，在高倍镜下每张切片按齿状回、CA1、CA3 区任选 3 个视野，计算阳性细胞数，取其平均数。数据由 SPSS 11.5 统计软件处理，试验数据以xs 表示，2 组间比较用 t 检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。P0.05 为差异有显著性。 2 结 果 2.1 动物行为学观察 A 组：注射戊四氮后 12 min 进入潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静或伏卧，随后出现眼神呆滞，头面部肌肉轻微抽搐，出现湿狗样抖动并伴有须动、耳抖和搔抓动作，继而进入大发作期，渐次出现前肢阵挛、奔跑跳跃、后肢站立伴头偏向一侧及全身阵发性抽动;达到 V 级发作的动物则表现为摔倒、翻滚等全身强直
11、-阵挛性发作，同时伴有喉鸣、口角流涎、肢端青紫等。整个发作持续约14 min 后逐渐缓解， 若出现连续多次发作则被剔除。B 组:注射生理盐水后无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。 2.2 病理形态学观察 B 组海马锥体细胞排列紧密、层次分明，细胞呈圆形或橢圆型，染色质在核内分布均匀，核仁清晰。A 组 1 天：海马CA1 区锥体细胞排列逐渐散乱，细胞肿胀，继之出现核固缩浓染、染色质浓集、细胞变小、细胞外出现空晕等改变。A 组 7 天：细胞排列散乱和细胞肿胀现象减轻，仍可见散在细胞胞质浓缩，并有少许鬼影细胞。A 组14 天：变性的神经细胞变为椭圆形或三角形，周围有小胶质细胞增生。 2.3 免疫组化
12、结果 A 组 bFGF 阳性细胞胞质、胞核均有着色，胞核更为明显，呈圆形、椭圆形。造模后 1 天 bFGF 表达在齿状回、CA1 和CA3 区均显著增高(P0.01)，发作后 7 天有所下降，但仍高于 B 组(P0.05)，发作后 14 天 bFGF 表达下降，和 B 组无显著性差异(P0.05)（见表 1，图 1） 。A 组 bFGF 阳性细胞表达增加以 CA1 区最明显，齿状回和 CA3 区次之。B 组各时间点海马 bFGF 表达一直维持在较低水平，且阳性细胞着色较淡。表 1 14 天大鼠海马不同部位 bFGF 阳性细胞数比较 3 讨 论 bFGF 是由 154 个氨基酸组成的多肽类生长因
13、子，被认为是一种神经胶质细胞有效的有丝分裂原，在正常脑组织， bFGF 主要分布在星形胶质细胞的神经核内。在海马中，研究发现 bFGF 主要定位于 CA1 区神经元。在正常状态下，海马有一定的 bFGF 基础表达，这对维持海马的正常功能是必需的， 有研究表明，缺血性脑梗死1和脑外伤2可诱导内源性 bFGF 表达增加，侧脑室注射外源性 bFGF 能减少癫疒间大鼠海马神经元的丢失，减轻海马损伤，促进行为恢复5 。 癫疒间发作后海马的 bFGF 表达在急性癫疒间和慢性癫疒间并不相同。研究发现点燃模型癫疒间大鼠脑内 bFGF 和 bFGFmRNA 水平在发作后 15 天内逐渐增高6 ，张广慧等3发现氯
14、化锂-匹罗卡品诱导成年急性癫疒间大鼠 bFGF 表达增高以发作后 1 天最为明显，以后逐渐下降，但在发作后 14 天仍然维持了较高的水平。本实验幼鼠单次惊厥海马 bFGF 表达亦以发作后 1 天为著，发作后 7 天其水平仍较高，而在发作后 14 天 bFGF表达已恢复至基础水平。由此看来，急性癫疒间只诱导 bFGF 短期表达，而慢性癫疒间则可诱导 bFGF 长期表达，2 者的机制可能不尽相同。此外不同癫疒间模型发作后海马 bFGF 表达空间分布也不尽一致， Riva 等7利用 （KA 海人藻酸）模型发现急性癫疒间定位于齿状回和 CA1 区，慢性癫疒间 bFGF 表达的长期效应在海马的各个区都有
15、反映，总的趋势是随时间表达不断增高，但以 CA1 区最为明显，其次是齿状回。本实验bFGF 的表达以 CA1 区和齿状回明显，这与 HE 病理染色海马形态学损伤较明显的部位是一致的。 本实验对大鼠年龄的选择基于人脑和大鼠脑发育程度的对应关系。普遍认为:14 天大鼠的脑发育程度与 1 岁儿童相当。我们的实验结果显示，在急性癫疒间中，幼鼠海马区的 bFGF 表达水平和时间和成年大鼠也不尽相同，大鼠出生 14 天内脑内 bFGF 较低，仅为成鼠的 208 ，由此推测幼鼠脑内 bFGF 受体亦可能未发育完全或受体数量相对少，从而导致急性惊厥后幼鼠海马 bFGF 表达的水平可能相对偏低而表达持续时间相对
16、较短，总之这种差异的具体机制尚待进一步探讨。 癫疒间后海马内源性 bFGF 表达增高对脑损伤保护作用的具体机制目前尚未完全阐明， 研究发现 bFGF 主要表达于对损伤比较敏感的星形胶质细胞，故推测 bFGF 表达的早期升高是星形胶质细胞对损伤的保护性反应，调节神经元的活动，阻止神经元的死亡。而在损伤的后期，bFGF 则参与了癫疒间后的苔藓纤维发芽（mossy fiber sprouting，MFS） 、神经发生和突触重建等脑可塑性变化过程，对维持神经元的存活与再生有重要的意义。有学者认为 bFGF 是促进 MSF 作用最强的神经营养因子9 。bFGF 能保护谷氨酸对海马、大脑皮层等部位的神经元
17、的兴奋性损伤，显著提高癫疒间模型海马区移植细胞的存活率，促进移植细胞的整合10 ，损伤刺激通过谷氨酸受体激活和加速钙离子内流机制诱导了 bFGF 基因及其受体在一些选择性脑区的表达增强，表达产物然后与细胞表面特异性受体相结合，结果引起钙离子依赖的谷氨酸受体表达下降和受体功能下调11 。朱丹彤等12研究发现进行迷宫训练的点燃大鼠 bFGF 表达增强，因而对于已经受到损伤的癫疒间大鼠脑功能起到保护作用，认为内源性 bFGF 的表达增加是对点燃大鼠记忆障碍的一种保护性反应。 儿童癫疒间发病率高而死亡率较成人低，且儿童时期是认知发育的关键时期。很多实验研究表明未成熟大脑惊厥导致脑损伤后突触重建、神经发
18、生和苔藓纤维发芽等可塑性变化与成熟大脑不尽相同，各种神经营养因子在这些过程中所发挥的作用还待我们进一步去研究。癫疒间发作后通过某些方法促进患者内源性 bFGF 合成或给予恰当的外源性 bFGF治疗可能对惊厥后的脑损伤有修复作用并且对受损的认知功能起一定的保护作用。 【参考文献】 1 张化彪，黎杏群.bFGF 和脑缺血损伤J.国外医学神经病学神经外科学分册，2002，29(1):62-65 2 吕 文，陈建良，杨 地，等.bFGF、VEGF 在大鼠创伤脑组织中的表达J.中华神经疾病杂志，2003，2(5):366-367 3 张广慧，张龙轩，朱遂强，等.碱性成纤维细胞生长因子在癫疒间大鼠海马中的
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