1、信号通路与心脏发育的关系【关键词】 Notch 信号;心脏发育细胞发育受到自身或外在的、近程或远程的信号调控，其中细胞之间的相互通讯在细胞发育中扮演重要角色1。在调控细胞发育的若干信号通路中，Notch 是相邻细胞之间互相通讯进而调控细胞发育的典型信号通路，并且越来越多的证据表明 Notch 信号介导的细胞间通讯在心脏发育过程中起重要作用，Notch 信号通路的突变会导致小鼠和人类心脏发育异常。现将 Notch 信号通路与心脏发育的关系综述如下。1 Notch 信号通路的分子组成Notch 信号通路的构成：完整的 Notch 信号通路由 Notch 受体、Notch 配体和细胞内效应分子 CS
2、L(CBF1、Suppressor of Hairless、Lag-1)，而 CBF1、Suppressor of Hairless、Lag-1 是这个蛋白在哺乳动物、果蝇、线虫的不同名称)DNA 结合蛋白等效应物、Notch的调节分子等组成。1.1 Notch 受体是一个相对分子量为 30000 的型膜蛋白，大约由2500 个氨基酸组成，羟基端在细胞质内，氨基端在细胞外。根据与细胞膜的关系大体上可分为胞外区、跨膜区、胞内区(Notch intracellular domain，NICD)三部分。胞外区和 NICD 均高度保守。胞外区包含一组串联排列的表皮生长因子样重复序列(epidermal
3、 growth factor-like repeats，EGFR)和 3 个 Lin/Notch 重复序列。EGFR 在 Notch 受体和配体结合中起关键作用，在果蝇中 Notch 受体的第 11 位和 12 位 EGFR 介导了其与配体结合。在哺乳动物细胞中，已经发现 4 种受体(Notch1-4)，其区别主要是 EGFR 重复序列。这些基因的表达遍及胚胎发育过程的各个组织，以及成熟组织中具有增殖能力的细胞层。跨膜亚基包括跨膜区、RAM序列、CDC10/锚蛋白重复序列、NCR(Notch Cytokine Response region)、PEST、多聚谷氨酰胺序列等结构域。CDC10/锚
4、蛋白重复序列是 Notch 分子中最保守和最基本的结构域，它不仅与其他蛋白分子直接作用，还具有反式激动功能。NCR 结构域具有细胞因子特异性。PEST 结构域与蛋白降解有关2。果蝇 Notch 和哺乳动物 Notch1-3 还有核定位信号和 OPA序列。1.2 Notch 配体与受体一样为型跨膜蛋白。果蝇 Notch 配体有 2个同源物 Delta 和 Serrate，线虫的 Notch 配体为 Lag2， 故又称 Notch配体为 DSL 蛋白。脊椎动物体内也发现了多个 Notch 配体，与 Delta 同源性高的称为 Delta 样分子，与 Serate 同源性高的被称为 Jagged。目
5、前，发现人类的 Notch 配体有 Delta-like 1、3、4 和 Jagged 1、2 配体， DSL 结构域在进化中高度保守，是配体与受体结合、激活 Notch 信号所必需的3。这些配体均是单次跨膜糖蛋白，其胞外区含有数量不等的 EGFR样重复序区，N 端由一个结合 Notch 受体所必需的 DSL 基序，Notch 配体的胞内域较短，只有 70-215 个氨基酸残基，功能目前不清楚。近年来研究发现，Delta1 的胞内域能够诱导细胞的生长抑制。1.3 细胞内效应分子 CSL DNA 结合蛋白 CSL 蛋白是一种 DNA 结合蛋白，是 Notch 信号通路中关键的转录调节因子。CSL
6、 是脊椎动物中的CBF1、果蝇中的 Su(H)及线虫中的 Lag-1 等转录因子的缩写，作为 Notch信号通路中的初级效应分子，NICD 进入细胞核后，其 Rel 同源区 N 端的B 折叠结构域与 Notch 的活化形式 NICD 结合形成 NICD-CSL 复合体，此复合体再通过 CSL 分子的 RHR 及其 N 端的 32-435 位氨基酸残基与 GTGCAA序列结合，进而激活靶基因的表达4。研究表明 Notch 信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)，如哺乳动物中的 HES(hairy/enhancer of split)
7、、果蝇中的 E(spl)(enhancer of split)等5。2 Notch 信号通路Notch 信号转导过程的特点是不需要第二信使和蛋白激酶的参与，就可直接接受临近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达，这种传导方式虽放大效率低，但特异性强，可基本避免其他信号的干扰。Notch 配体与受体结合后，在 TACE(Tumor necrosis factor -converting enzyme,TACE)作用下，Notch 受体于细胞膜外被酶切，释放出和 Notch 配体连接的胞外部分 J。随后在 y 一分泌酶的作用下，胞内段被酶切，形成可溶性的 NICD 转移至核内，通过激活转录
8、因子 CLS 而调节基因表达。CSL 作为 Notch 信号通路的初级效应分子，通过其 N 端的 B 折叠结构域与 NICD 结合形成 NICD-CSL 复合体后，再通过 N 端的 31-435 位氨基酸残基与 GTGGGAA 序列结合，进而激活靶基因的表达。Notch 信号的靶基因多为 bHLH 家族转录因子，如较常见的 HES。近年来又发现另一类不同的 bHLH 家族分子 HERP(HES-related repressor protein，HERP)，其既可形成同型二聚体，也可与 HES 形成异型二聚体而激活下游基因的表达。Notch 信号转导过程的特点是不需要第二信使和蛋白激酶的参与，
9、就可直接接受临近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达，这种传导方式并不能放大信号，但对于细胞分化起始过程的精确调控是十分必要的。另一种 Notch 信号转导途径为非 Su(H)/CBF1 依赖性。近来报道果蝇 Notch 结合蛋白 deltex 是非 Su(H)依赖性信号必需的。Notch激活后，deltex 不进入细胞核而与是 Grb2 作用介导 Ras-JNK(c-jun N-terminal kinase)途径，如 Notch/Delta 转导的信号可以抑制 Ras 和 JNK依赖性的 bHLH 家族转录因子 E47 的活性6。3 Notch 信号与心脏发育的关系3.1 Not
10、ch 组件的表达心脏是第一个开始发生的器官，血管系统的发生则紧随其后，两者组成一个心血管循环系统7。心血管系统又是第一个行使功能的系统，其他所有器官的发育和生长都要依靠该系统提供营养和氧气。胚胎时期的循环系统由血管，心脏和造血系统构成 均由中胚层发育来的。中胚层的形成和进化及心室脊的阶段的发育都受到外胚层和内胚层信号通路严密的调节。在小鼠胚胎发育过程中有不同的 Notch 受体表达，心血管系统中各个受体的表达模式也不尽相同。鼠胚胎第 7.5 天时，Notchl 首先表达于原条阶段中胚层。在小鼠胚胎 8.5 天，Notch1 主要表达于原始心管流出道内膜层,它对原始心管内膜细胞亚类的调节具有重要
11、意义8;通过对 Notch1 通路功能缺失突变的研究发现 Notch1 受体单倍剂量不足导致了主动脉瓣疾病，证明了它在心内膜细胞进入心胶质形成心内膜垫和瓣膜过程中的作用9。RBP-J 突变的小鼠心内膜垫形成阶段的 Delta 和Jagged 配体的表达显著减少，导致了心瓣膜的发育异常;同时研究发现：斑马鱼心脏内注射构成型活化的 NICD 刺激了心内膜的有丝分裂，导致了心瓣膜的肥大10。研究发现人类基因 Notch1 表达不足能导致主动脉瓣膜的钙化。Notch4 和 delta-like 4(Dll4)亦于心内膜中表达，而 Notch2直到第 13.5 天才出现在心房和心室肌中;Notch3 在
12、早期头褶阶段表达于生心板中而于第 8 天消失。第 9.5 天时，delta-like 1(Dill)出现于心室小梁肌底部心内膜区;而从第 12.5 天开始，Jaggedl 在心室流出道房室区、心房肌和心室小梁肌部均有表达。通过对小鼠和斑马鱼的 Hey 基因功能分析发现，Notch 信号的靶基因 Hey 基因的表达模式与 Notch 大体相仿，证明了在心血管形成过程中Hey 基因是 Notch 信号途径中最明显的转录因子。Heyl 和 Hey2 从心脏发育的早期就一直在心脏中表达。其中，Hey1 只在心房表达，而 Hey2 则在心室表达11。在出生前后，Hey1 和 Hey2 在心脏中的表达就逐
13、渐地降低。敲除了 Hey1 或 Hey2 的纯合体小鼠依然能够生存并且繁殖后代，可能的原因是 Heyl 或 Hey2 功能缺陷可被其他 Hey 基因部分地弥补。而 Hey2 的敲除会导致一个大的并延伸到肌性部的膜性室问隔缺损(VSD)，同时伴随双侧心室肥大。在很多情况下，还会出现更复杂的异常，如三尖瓣狭窄或闭锁、肺动脉瓣狭窄、卵圆窝永存或房间隔缺损(ASD)。但是迄今为止，在 VSD 和 Alagille 综合征的病人中还没有检测到 Hey2 编码区的突变12。然而 Li FB 等通过对一 Alagille 综合征患者研究发现 Jag1 基因突变，证明了 Alagille 综合症和 Notch
14、 信号信号通路相关13。3.2 Notch 信号与房室管发育研究已经证实激活和阻断 Notch 信号通路均会导致房室管发育异常。研究表明 jagged1、hey-2、Hey1/2、 Hey1/L、CSL 缺陷及 Notch1过渡表达均会导致房室管发育异常14。Rutenberg 等通过对鸡心脏Notch1 和 Notch2 的研究发现，鸡心脏只表达 Notch2 而不表达Notch1。Notch1 的受体 jagged1 起初只在在心脏管的心肌中表达，但随房室管的发育表达逐渐消失。靶基因 hey1 在心房心室同时表达，而 hey2只在心室表达。这种表达模式说明 jag1/2，Notch2, a
15、nd Hey1/2 都参与了调节房室交界区分化。过度表达 Hey1 或 Hey2 可以减少 BMP2 在房室管的表达，说明 Notch 信号通路通过诱导 hey 基因抑制 BMP2 表达15。Donovan 等研究发现 Hey1/ Hey2 双突变小鼠会在出生后一周会因严重的心脏缺陷如室间隔缺损、肺动脉狭窄、房室瓣病变及心室肥厚出现死亡率显著增高，Hey1 和 Hey2 基因联合缺失则会在胚胎发育 9.5 天时发生严重的心室肌肉变薄和动脉分化异常心脏畸形而导致死亡16。3.3 Notch 促进心脏发育中 EMT 的形成房室管形成后，在邻近心肌诱导信号刺激下心内膜细胞发生形态学改变，上皮-间叶细
16、胞转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，侵入深层的心胶质中形成心内膜垫，并进一步重塑形成瓣膜组织。发育过程中调控 EMT 发生在心脏发育的的最初阶段。房室管 EMT 在小鼠胚胎发育 9.5 天开始房室管的心内膜表达 Notch 受体1、2、4 和配体 jagged1 和 Dll4，激活 Notch 通路是诱导房室管 EMT 所必需的。研究发现 Notch1 缺乏会导致 EMT 的发生，Notch 还可以通过下游靶基因调节间充质细胞的形态17。Notch 受体及配体的表达是通过VEGF( Vascular endothelial growth
17、factor)通路调节的。VEGF 通路必须在 EMT 前被 Notch 的靶基因 Hey2 所抑制，hey 基因参与调节间充质细胞的形态，部分与调节 MMP2(matrix metalloproteinase 2)有关。Notch调节 EMT 是通过 TGF 通路调节 Snail 表达和和直接调节 snail 完成的。当 Notch 和 TGF 被激活，VEGF 通路会抑制，与此同时 EMT 低下18。Notch 调节 EMT 的机制是血管内皮钙粘蛋白在房室管心内膜表达的负向调节19。EMT 还与转录因子 Snail 家族密切相关，后者能够下调 VE 钙黏蛋白的表达。Notchl 突变造成
18、Snail 和 Slug 基因表达下降，减弱了对VE 钙黏蛋白的抑制作用而导致心内膜垫细胞数量明显下降;Notch 信号通路通过 Sail 家族成员抑制血管内皮钙粘蛋白的表达而启动 EMT 且不受hey 基因影响，而 hey 基因只参与调节间充质细胞的表型。3.4 Notch 信号与心室发育 心室发育过程中心肌前体细胞分化为外部致密层和内部肌小梁层。在胚胎发育 9.5 天发现 Notchl 和 Dill4 于小梁层底部的心内膜表达20，而敲除 Notchl 大鼠胚胎肌小梁形成缺陷且失去特征标志物表达能力;而 Notchl 过度表达则导致房室管区出现异位表达的小梁肌。小梁肌的形成需要 EphB2
19、 及其受体 EphB4、神经调节蛋白 NRGl 及其受体 ErbB2，4 和 BMPl0 的共同参与。NRGl、ErbB2 或 ErbB4缺陷均可能导致胚胎死亡和严重的肌小梁发育障碍;而外源性 BMPl0 或NRGl 能够补救敲除 Notchl 的心室发育缺陷，证明心内膜 Notch 信号作为上述基因的上游调节因子在肌小梁发育过程中具有重要作用。Notch 主要的靶基因 Hey2 的功能已经通过该基因敲除小鼠的表现予以证明。该基因缺失的纯合小鼠死于生后的第一周，该小鼠出现了三尖瓣畸形、室间隔缺损和法乐氏四联症，血流动力学分析还显示了左心室功能的下降，并且左心室中检出较多心房组织标志物(ANF、
20、Tbx5、Mlcla/2a)21;而当Hey2 过度表达时，心房标志物表达水平明显下降，这表明 hey2 是心房和左心室肌小梁基因表达所必需的。Hey2 通过以下两个机制调节肌小梁基因的表达：(1)是 hey2 直接抑制心房和肌小梁 ANF, Cx40 积基因的表达;(2)是 hey2 阻断 GATA4/6 的表达。3.5 Notch 信号与流出道发育(outflow tract，OFT)流出道是由次级心脏域，神精脊和心内膜细胞分化而来。当次级心脏域发育成 OFT 心肌，神精脊衍生细胞迁移到 OFT 垫，OFT 垫把 OFT 分隔为主动脉和肺动脉22。Notch 的受体配体及目标基因的表达在
21、OFT发育中起到多重的作用包括：心脏神精脊细胞分化为主动脉弓的血管平滑肌细胞。在主动脉和主动脉弓发育过程中其内皮表达 Notch1 和 Notch4受限，相反的 Notch2 和 Notch3 表达在心脏神精脊及其衍生的主动脉弓的血管平滑肌周围。Jagged1 也在主动脉弓周围的血管平滑肌细胞上表达，jagged2 表达更为广泛和 jagged1 表达有重叠。Dll1 只表达在心内膜而主动脉弓内皮细胞没有表达，Dll4 在主动脉弓内皮细胞和心内膜都有表达，Dll3 在主动脉或主动脉弓均无表达23。当 Notch 通路被阻断时，诱导血管平滑肌细胞的标记物不会出现，说明 Notch 与心脏神精脊细
22、胞分化为主动脉弓的血管平滑肌细胞有关。神经嵴含有多种背侧神经管来源的前体细胞，在分化前阻断 Notch 信号可引起明显的血管平滑肌细胞数量下降，产生肺动脉狭窄和主动脉弓缺陷等类似于 Alagille 综合征的表型特征。小鼠的 hey-2 基因缺乏导致心血管畸形包括法四和肺动脉狭窄，也证实了 jag-1、Notch2 和 hey2 与 Alagille 综合征有关24。4 展 望心脏是人体生存和活动不可缺的重要器官，而心脏的发生和发育又是一个非常复杂和精细的调控过程。Notch 信号通路在心室肌小梁形成和 EMT 等心脏发育的过程中起着重要作用。但是其精确的调控具体机制仍不明确，但 Notch
23、调控心脏发育的功能已被证实，因此 Notch 信号通路作为潜在的治疗的靶位基因具有广阔的研究前景及临床意义，对于将来预防及先天性心脏病的发生早期干预及心血管疾病的治疗具有重大的临床意义。【参考文献】1 Radtke F, Fasnacht N, Macdonald HR. Notch signaling in the immune systemJ.Immunity. 2010，29，32(1)：14-27.2 Rechsteiner M Regulation of enzyme levels by proteolysis: the role of pest regionsJ.Adv Enzym
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