1、血清 -球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践作者：伊德林 汪亚伦 金明林 冮 岩 邹黎明 【摘要】为改革生物化学实验，提高实验教学水平，对“血清 -球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合，建立了综合性实验“血清 -球蛋白的分离、纯化与鉴定” ，实现实验内容和生化技术的综合与创新。经过 4 年的医学本科生教学实践，实验方法稳定，结果重复可靠，适合实验教学，有利于提高大学生的综合实验技能。 【关键词】-球蛋白 综合性实验 创新 血清 -球蛋白又称免疫球蛋白（Ig） ，具有重要的医药应用价值。许多医学院校把提取血清 -球蛋白作为生化实验教学内容。本室于2007 年初，对原有生化实验 “
2、血清 -球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新，选用猪血清，保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤，增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及 SDS-PAGE 法鉴定提取的血清 -球蛋白纯度，建立并开设了 16 学时的综合性实验“血清 -球蛋白的分离、纯化与鉴定” 。通过血清 -球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验，涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式，使学生受到一次综合性生化技能训练，提高了实验教学效率和效果。 1 材料与方法 1.1 仪器材料 1.1.1 仪器 K
3、DC-40 低速离心机、1.5cm20cm 玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C 电泳仪及 DYCZ-24D 型垂直板电泳槽。 1.1.2 试剂材料 新鲜猪血清、pH7.0 饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水） 、葡聚糖凝胶 G25（SephadexG-25） 、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6 离子强度 0.06 巴比妥缓冲液、氨基黑 10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA（牛血清白蛋白）等，除 SephadexG-25 外均为国产。 1.2 方法 1.2.1 取新鲜猪血清 2ml，加入等量 PBS，
4、逐滴加入 2ml 饱和硫酸铵溶液，混匀后静止 30 分钟，3000rpm10 分钟，将沉淀用 1mlPBS 溶解，缓慢加入 0.5ml 饱和硫酸铵溶液，混匀后静止 30 分钟，3000 rpm10 分钟，沉淀物即是 -球蛋白。该步骤可重复 1 次，以保证纯度。 1.2.2 将纯化的 -球蛋白溶于 0.5mlPBS，通过凝胶(SephadexG-25)层析，用 PBS 洗脱，除去蛋白质中的小分子铵盐。洗脱下来的收集液用磺基水杨酸检测蛋白质的存在，用奈氏试剂检测是否除净 NH4+,然后把含有蛋白的样品合并收集。 1.2.3 把纯化的 -球蛋白与正常猪血清样品进行醋酸纤维素膜（48cm）电泳作对照验
5、证。 1.2.4 把纯化的 -球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其含量，并稀释成 2mg/ml。 1.2.5 把纯化的 -球蛋白、正常猪血清及 BSA（标准蛋白 2mg/ml）分别用含巯基乙醇的样品缓冲液（11）处理，用 12%分离胶进行 SDS-PAGE 1，作进一步对照验证。 2 实验结果 2.1 醋酸纤维素膜电泳结果 由下（正极）至上（负极）纯化的 -球蛋白样品为一条带；正常猪血清样品为五条带（清蛋白、1、2、 及 -球蛋白） 。 2.2 SDS-PAGE 结果 由下（正极）至上（负极） ，正常猪血清样品出现十几条带，在清蛋白前面出现二条带且与纯化的 -球蛋白样品
6、出现的二条带相平行。标准蛋白为纯一条带且与正常猪血清样品的清蛋白相平行，而纯化的 -球蛋白样品无明显清蛋白，其他蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅。 3 讨论与体会 3.1 努力探索，适合实验教学的突破 3.1.1 实验原理清楚，方法稳定可靠 血清中的 -球蛋白是一类结构相似的多种蛋白质，分子量在 160-200Kda 之间，基本结构由两条分子量相近的重链（链 50-75Kda）和两条分子量相同的轻链(链25Kda) 通过二硫键连接组成。人和动物血清中的 -球蛋白主要成分为IgG，猪血清 IgG 的链分子量约为 57Kda,链分子量约为 26Kda2。 纯化的 -球蛋白、正常猪血清在同一
7、张醋酸纤维素膜上电泳，纯化的 -球蛋白样品为一条带；正常猪血清样品为五条带。把纯化的-球蛋白、正常猪血清及标准蛋白用含有巯基乙醇的样品缓冲液处理后进行 SDS-PAGE ，可使纯化的 -球蛋白、正常猪血清中的 -球蛋白还原成轻链和重链而出现二条带，且相互平行；而标准蛋白不含二硫键，不能解链，故只出现一条带且与正常猪血清中的清蛋白相平行。至于纯化的 -球蛋白样品无明显清蛋白，其他蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅是经盐析后已分离出大部分，但经高灵敏度的 SDS-PAGE 仍可不同程度的显现出痕迹。 分离、纯化 -球蛋白，选用硫酸铵分段盐析、离心分离、葡聚糖凝胶层析出盐是实验教学，医药研究、
8、生产常用的方法，不仅保证其相对纯度，节省时间，更重要的是保证其完好的生物学活性；把纯化的 -球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其浓度；采用醋酸纤维素膜电泳和 SDS-PAGE，对蛋白质提取纯度比较，是较为经济、快速且可重复的方法，尤其是 SDS-PAGE，已成为现代科学许多研究领域广为应用的重要分析和分离技术。 3.1.2 材料来源方便，节省实验经费。 3.1.3 结构安排合理，实验可分可合。 3.2 立足基本，实现技术全面的创新 实验覆盖了传统生化四大技术，包括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技术，同时电泳技术又采用了二种电泳法的对比实验。实验操作上，从刻度细管使
9、用做起；实验涉及的试剂中，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有一定神经毒性，采用可调玻璃加液器在实验室前台集中加液，既避免对环境污染又保证使用试剂的速度；对于上样或微量试剂操作选用微量进样器或可调式移液器。在 -球蛋白的分离、纯化过程中从经典的硫酸铵盐析法的应用到近代的分子筛层析除盐；从化学的基本显色和沉淀法的应用到比较先进的 -球蛋白分子解链，整个实验的原理清楚，难易适度，循序渐进。 3.3 突出综合，提高学生动手的能力 增加了知识的综合性，提高学生对实验的极大兴趣。学生都渴望自己的实验有满意的结果，势必从第一步操作开始，到最后做出实验结果，一点都不能含糊，认真主动的做好每一步，去求证理论的依据，去发
10、现新的问题，达到了锻炼学生动手能力的教学目的，使理论与实践有机结合。 3.4 不断进取，加强教学方法的改进 高度注重学生综合素质和实验能力的培养，解决实验教学中教与学的对立统一是提高教学效果的重要方面。把实验教学内容做成课件，采用多媒体视听教学，使实验教学更具直观性、趣味性、多样性。由于实验内容多、技术和方法全面，涉及问题也比较多，在实验课前，要求学生必须预习实验讲义，通过课堂上提问检查，教师有的放矢，指出操作中的注意事项，让学生独立完成实验；在实验间隙或实验总结时，组织学生对实验现象和结果进行讨论，师生互动，有力的提高了学生独立思考和解决问题的能力，对于实验的深度和广度起到了画龙点睛的作用。 参 考 文 献 1张龙翔,张廷芳,李令媛.生化实验方法和技术M.人民教育出版社,1981，112-119. 2孙高超,孙圣君,刘高升等.猪血免疫球蛋白 G 提取及分子量测定J.安徽农业科学，2009，37(23):11017-11018,11039.
