1、修饰 hTERT 核心启动子靶向转录 FCY1 的重组腺病毒的构建及鉴定作者：滑玮，辛晓燕，苏明权，李立文 【关键词】 末端转移酶 【Abstract】AIM：To construct and identify transcriptional targeting replication-defective recombinant adenoviruses containing FCY1 driven by hTERT core promoter modified by estrogen response elements and hypoxiaresponsive elements. METH
2、ODS: The hTERT core promoter modified by tandem sequences of estrogen response elements and hypoxiaresponsive elements were constructed. The promoter sequence and the FCY1 gene fragment were subcloned into shuttle plasmid, then the shuttle plasmid and rescue plasmid were used to cotransfect the HEK
3、293 cells. Thus the recombinant adenoviruses were obtained. The viral DNA was identified by PCR reaction. After the amplification, the recombinant adenoviral titer was determined by endpoint dilution assay. RESULTS: The sequence of the modified hTERT core promoter was identified by DNA sequence anal
4、yses. Typical cytopathic effect (CPE) appeared in all the infected 293 cells within 710 days after cotransfection. PCR reactions showed that the viruses amplified the 122 bp targeted fragment. The recombinant adenoviral titer determined by endpoint dilution assay was 62107 pfumL-1. CONCLUSION: Repli
5、cationdefective recombinant adenoviruses containing FCY1 driven by hTERT core promoter modified by tandem sequences of estrogen response elements and hypoxiaresponsive elements are successfully constructed and recombinant viruses of high titer have been obtained. 【Keywords】 telomerase promoter；regio
6、ns(genetus)；estrogen response element；hypoxiareponsive element；transcriptional targeting；ovarian neoplasms 【摘 要】目的： 构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶（FCY1）的复制缺陷型重组腺病毒.方法： 构建由雌激素反应元件（ERE）和缺氧反应元件（HRE）串联重复序列共修饰的 hTERT核心启动子，将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶(FCY1)基因插入穿梭质粒，用穿梭质粒与辅助质粒共转染 HEK 293细胞，获得重组
7、腺病毒载体AdEHhTFCY1，经 PCR鉴定证实后，采用终点稀释试验测定病毒滴度. 结果： 经 24HRE与 8ERE共修饰的 hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确；穿梭质粒和辅助质粒共转染的 HEK 293细胞，在转染后 710 d出现了典型的细胞病变反应（CPE） ， PCR 反应能扩增出 122bp的目的片段，终点稀释试验测定得到的病毒滴度为 62107 pfumL-1. 结论：成功构建并获得高滴度的 ERE与 HRE串联重复序列共修饰的 hTERT核心启动子引导 FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒. 【关键词】 端粒，末端转移酶；启动区（遗传学） ；雌激素反应元件；缺氧反应元件
8、；靶向转录；卵巢肿瘤 0 引言 在恶性肿瘤的基因治疗中，酶解前体药物策略已得到广泛的应用1，2.然而，由于缺乏对肿瘤细胞的选择性，使其在临床实践中的进一步应用受到限制.如何把前体药物转换酶基因的表达严格限制在肿瘤细胞中，是提高该策略治疗指数的关键.近年来，转录调控成为肿瘤基因治疗的研究热点3 ，即根据肿瘤细胞与正常细胞分子间的差异，在转录水平上对治疗基因的表达进行调控. 人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子已被用作靶向转录启动子对多种肿瘤进行了基因治疗的实验研究4,5.我们构建了 hTERT核心启动子引导酵母源性胞嘧啶脱氨酶基因（FCY1）表达的重组复制缺陷型腺病毒载体，使目的基因的表达限制在
9、肿瘤细胞中.另据报道，雌激素可通过与雌激素受体的结合及与雌激素反应元件（ERE）的相互作用，激活 hTERT的表达6 ；而采用缺氧反应元件（HRE）修饰启动子可使目的基因在瘤体内的表达相对特异7.我们根据卵巢癌的内分泌特点及瘤体内缺氧的特征，构建 ERE和 HRE的串联重复序列，作为顺式作用元件，进一步提高 hTERT启动子在卵巢癌细胞中的活性，进而使治疗基因在卵巢癌组织中高效特异的表达. 1 材料和方法 1. 1 材料 自行设计含有 2个 ERE的模板序列：S58序列（5GGT ACC TCT AGA GTC GAC GGT CAC AGT GAC CGG TCA CAG TGA CCC A
10、CT CGA GAC GCG T3） ，并根据以上模板序列设计引物PP1（5GGT ACC TCT AGA GTC 3） 和 PP2（5ACG CGT CTC GAG TG 3） ，模板及引物均由上海生工生物工程公司合成；含有人端粒酶逆转录酶核心启动子的 pGL3181hTERT质粒由日本 Kanzawa大学 Satoru Kyo教授惠赠；含有酵母胞嘧啶脱氨酶 FCY1基因的 pCIneoFcy1质粒由法国Transgene研究所 Philippe Erbs教授惠赠；克隆载体 pSP73购自Promega公司；腺病毒载体构建系统 AdMax Kit D购自 Microbix Biosystem
11、 Inc.(Canada)；低传代 HEK293细胞购自 Microbix Biosystem Inc.(Canada)；高糖型 DMEM培养基购自 GIBCO BRL. 1.2 方法 1.2.1 穿梭质粒的构建 以引物 PP1 和 PP2通过PCR反应扩增模板 S58，拟扩增片段长度为 58 bp，将 PCR产物在 20 gL-1TAE琼脂糖凝胶上以 50 V，50 mA 电泳 30 min，切取 58 bp对应之凝胶，用 CLONTECH Gel Extraction Kit回收 DNA，将回收的 DNA片段进行 XbaI+XhoI双酶切，所切下片段插入 pDC312载体，得到pDC312
12、2ERE；进而，根据 SalI和 XhoI为同尾酶的特点，分别构建以下各质粒：pDC3124ERE，pDC3128ERE 和 pDC31224HRE8ERE181 hTERT.经测序证实 ERE重复序列与设计完全相符. pDC31224HRE181 hTERT的构建参照文献8进行.然后，将由质粒 pCIneoFCY1经 NheI+EcoRI双酶切得到的 FCY1片段插入质粒 pDC31224HRE8ERE181 hTERT，再以 XbaI+EcoRI将启动子及治疗基因切下，插入质粒 pDC316获得 polyA尾，得到pDC31624HRE8ERE181 hTERT穿梭质粒. 1.2.2 细胞
13、培养 低传代的人胚肾 HEK293细胞用含有 100 mLL-1胎牛血清及双抗（青霉素 100 gmL-1,链霉素 100 gmL-1）的 DMEM培养基常规培养. 1.2.3 重组腺病毒的构建 转染前 24 h将（56）106 个 HEK293细胞传代至 50 mL培养瓶中，置于 37, 50 mLL-1CO2饱和湿度条件下培养，待细胞达到 50%-70%汇合时，转染前 1 h，将培养基换为无血清培养基；用 CONCERT高纯质粒提取试剂盒提取穿梭质粒 pDC31624HRE8ERE181 hTERT和辅助质粒 pBHGlox(delta)E1,3Cre；用穿梭质粒和辅助质粒各 5 L 加
14、5 L LipofectAMINE2 000脂质体共转染 HEK293细胞，置于 37, 50 mLL-1CO2孵箱中，4 h后将培养基换为含 100 mLL-1胎牛血清的 DMEM培养基，继续在 37, 50 mLL-1CO2饱和湿度条件下培养；定期观察是否有 CPE出现，待有明显 CPE且约 50细胞从培养瓶底脱落时，收集病毒，经-70和 36反复冻融 3次后离心，取上清置于-70保存. 1.2.4 重组腺病毒的鉴定 取 100 l 病毒粗提液，加入常规裂解液（02 moLL-1 NaOH , 50 mmolL-1 Triton X100, 10 mmolL-1 SDS）,振荡混匀，100
15、水浴 20 min，12 000 g离心 10 min，取上清作为模板；根据 FCY1基因序列（GeneBank access number, U55193）使用 Primer Premier (Version50,PREMIER Biosoft Inc.)软件设计鉴定引物：上游引物为5CTT ATC AAT AAC AAA GAC GGA AGT G 3 ，下游引物为 5TTG CCC TCT AAT CTC CCA CA 3；扩增片段长度为 122 bp（291412） ，循环参数为 94 30 s，55 30 s，72 30 s，36 个循环，最后延伸 10 min.反应结束后在 20
16、gL-1TAE琼脂糖凝胶电泳上鉴定，以 pCIneoFCY1质粒 NheI+EcoRI双酶切得到的 FCY1片段凝胶回收产物作为阳性对照，以未转染之正常 HEK293细胞中提取的 DNA作为阴性对照. 1.2.5 重组腺病毒的扩增及滴度测定 用已获得的重组腺病毒感染 HEK293细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释试验中滴度计算公式为：病毒滴度（pfumL-1）10（x08） ，x 为各行阳性率总和. 2 结果 2.1 重组腺病毒的构建 在脂质体的介导下，被穿梭质粒 pDC31624HRE8ERE181 hTERT和辅助质粒 pBHGlo
17、x(delta)E1, 3Cre共转染的 HEK293细胞，在转染后的 710 d均出现了典型的细胞病变反应（cytopathic effect , CPE）, 即细胞变圆、折光性增强，随后出现串珠样改变直至葡萄簇样改变并从细胞培养板底脱落.正常 HEK293细胞如 Fig 1所示，出现 CPE的 HEK293细胞如 Fig 2所示. 2.2 重组腺病毒的 PCR鉴定 以病毒粗提液提取出的 DNA为模板，可扩增出 122 bp的目标片段，DNA 凝胶电泳结果如Fig 3所示. 2.3 重组腺病毒的滴度测定 经终点稀释试验测定之重组复制缺陷型腺病毒滴度为 62107pfumL-1. 图 1 正常
18、 HEK293细胞（略） Fig 1 Normal HEK293 cells 100（略） 图 2 HEK293细胞出现 CPE（略） Fig 2 Cytopathic effect of HEK293 cells 100（略） 1：50 bp DNA ladders； 2：Products of PCR of DNA from recombinant adenoviruses；3：Positive control；4：Negative control；5：50 bp DNA ladders. 图 3 重组腺病毒 DNA的 PCR扩增产物（略） Fig 3 PCR Products of DN
19、A from recombinant adenoviruses（略） 3 讨论 3.1 端粒酶及 hTERT的表达调控 研究表明，在85以上的恶性肿瘤中都有端粒酶的激活，而在正常体细胞中其活性则受到严格限制（除了生殖细胞和干细胞等） ，端粒酶重新活化被认为是肿瘤发生的关键步骤.端粒酶的活性主要由 hTERT决定，而 hTERT基因表达的调控主要发生在转录水平上，这样就可以使用 hTERT启动子作为调控序列来控制治疗基因的表达.Tzukerman 等对不同长度 hTERT启动子引导的荧光素酶基因表达载体进行分析后认为，位于 hTERT基因转录起点上游的长为 283nt的最小核心启动子具有最大活性
20、，而用该启动子驱动的基因载体转染细胞后发现启动子在未分化细胞中表现最大活性，且随着诱导分化的进行其活性以时间依赖方式显著降低9.故选用 hTERT核心启动子作为转录靶向启动子，可使 hTERT启动子发挥自身的最大活性. 3.2 ERE，HRE 对 hTERT核心启动子的修饰 尽管端粒酶启动子在肿瘤组织中有不同程度的激活，但是若将其用于转录靶向引导治疗基因的表达，其活性还是远远不够的；而且，hTERT 启动子在造血干细胞、生殖细胞和激活的淋巴细胞也有不同水平的表达活性，它可能造成的毒副作用限制了其在基因治疗中的应用，为了进一步增强hTERT核心启动子的活性，并且提高启动子激活的选择性，减少毒副作
21、用，在基因治疗的研究中需要对其进行修饰. 雌激素反应元件（ERE） ，是位于雌激素反应性基因启动子区 5末端的特异性顺式反应元件.研究表明，在表达雌激素受体（ER）的细胞中，雌激素可与胞质内的 ER结合，通过 ERE直接激活人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达；同时，在 hTERT核心启动子序列中还存在两个 cMyc结合位点（cMyc 是 hTERT转录的直接激活因子之一） ，雌激素亦可通过激活 cMyc的表达而间接激活 hTERT10.卵巢不仅是雌激素的产生器官，也是雌激素的靶器官之一，这样卵巢癌就具备了天然的雌激素环境，而且大部分卵巢癌细胞都有雌激素受体的分布.本研究尝试应用 ERE的串联
22、重复序列修饰 hTERT核心启动子，则雌激素不但可以通过激活 cMyc的表达激活 hTERT启动子的活性，而且还可以通过 ERE进一步增强 hTERT启动子在卵巢癌细胞中的活性. 在肿瘤的发展过程中，由于血管的结构和功能异常造成微血管密度增加和瘤内缺氧并存，体积超过 1 mm3的肿瘤组织即会出现局部缺氧，大部分的实体肿瘤中都普遍存在着严重的缺氧11.在缺氧适应性基因启动子中都含有顺式作用的缺氧反应元件（HRE） ，Binley 等构建了由HRE调控 lacZ转录的复制缺陷型重组腺病毒，并证实在生理氧张下被该病毒感染的细胞仅有极低水平的 lacZ表达，而在缺氧状态下其表达水平迅速升高12.故使用
23、缺氧反应元件串联重复序列可大幅度提高 hTERT核心启动子在缺氧环境中的活性. 我们采用 ERE和 HRE的串联重复序列共同修饰 hTERT核心启动子，不仅能利用肿瘤缺氧的特点上调启动子活性，而且还能使启动子在卵巢癌组织中的活性进一步提高，即使启动子选择性在卵巢癌组织中激活，进而使目的基因 FCY1的表达严格限制在卵巢癌细胞中，为卵巢癌特异性化疗的实验研究及临床应用奠定了基础. 【参考文献】 1 Hiroki S，Hideyo S, Asako M. Transcriptional activation of the thyroglobulin promoter directing suici
24、de gene expression by thyroid transcription factor1 in thyroid cancer cellsJ. Cancer Res，2001；61: 3640-3646. 2 Kentaro U, Makoto I, Mikihito N. Carcinoembryonic antigenspecific suicide gene therapy of cytosine deaminase/5fluorocytosine enhanced by the cre/loxP system in the orthotopic gastric carcin
25、oma modelJ. Cancer Res，2001；61：6158-6162. 3 Harrington KJ, Linardakis E, Vile RG. Transcriptional control: An essential component of cancer gene therapy strategiesJ.Adv Drug Deliver Rev，2000；44:167-184. 4 Helder MN, Wisman GB, Zee GJ. Telomerase and telomeres：From basic biology to cancer treatmentJ.
26、 Cancer Invest，2002；20(1)：82-101. 5 Mergny JL，Riou JF，Mailliet P. Natural and pharmacological regulation of telomeraseJ. Nucleic Acids Res, 2002；15(4)：839-865. 6 Misiti S, Nanni S, Fontemaggi G. Induction of hTERT expression and telomerase activity by estrogens in human ovary epithelium cellsJ. Mol
27、Cell Biol，2000；20(11)：3764-3771. 7 Dachs GU, Patterson AV, Firth JD. Targetting gene expression to hypoxia tumor cellsJ. Nat Med，1997；3：515-520. 8 Li LW，Wang Z，Su MQ. Construction of replicationdefective recombinant adenovirus with FCY1 driven by multimer of hypoxia responsive elementsmodified hTERT core promoter. J.Disi Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2002；23（12）：1061-1064. 9 Tzukerman M, Shachaf C, Ravel Y. Identification of a novel transcription factor binding element involved in the regulation by differentiation of the human telomerase (hTERT)
