1、乙脑病毒 E 蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定作者：高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯 【Abstract】 AIM: To construct gene encoding Japanese encephalitis virus (JEV) envelope glycoprotein and to express E protein in BL21(DE3). METHODS: Using RTPCR, the gene encoding E protein was amplified. The gene was cloned into pET28a(+) and th
2、e recombinant plasmid pET286HisE was transformed into BL21(DE3). The 6HisE protein expressed in BL21(ED3) was determined by SDSPAGE and Western Blotting. The expression product in inclusion body was purified by NiNTA chromatography. RESULTS: Sequencing of E gene revealed that the mutation rate was 0
3、.2(3/1500) and the base mutation didnt change the amino acid nonsense. The recombinant expression vector pET286HisE was constructed and the 6HisE protein was successfully expressed in an insoluble form. After expression and purification by metal chelate affinity chromatography, purified 6HisE fusion
4、 protein was obtained. CONCLUSION: The E protein can be expressed in prokaryotic cell and would be useful for further research on the receptor of JEV and its infection mechanisms. 【Keywords】 encephalitis virus, Japanese; viral envelope proteins; recombinant fusion proteins 【摘要】目的： 构建乙脑病毒（JEV）E 蛋白重组载
5、体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法： 采用 RTPCR 扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重组载体 pET28a6HisE 转化 BL21(DE3),通过酶切、SDSPAGE 和 Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达；表达产物包涵体经 NiNTA 亲和层析纯化. 结果： 构建得到原核融合重组载体pET28a6HisE ；诱导后表达得到 6HisE 融合蛋白，纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论： 表达并纯化得到 JEV E蛋白原核表达产物. 【关键词】 脑炎病毒，日本；病毒包膜蛋白质类；重组融和蛋白质类 0 引言 流行性乙型脑炎（Japanese
6、encephalitis, JE）简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒（JEV）所致的中枢神经系统性传染病1. JEV属包膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径 2030 nm，核心含单股 RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即 E蛋白、核蛋白 C和膜蛋白 M. E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体2. 我们对 E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件. 1 材料和方法 1.1 材料 pET28a(+)表达载体和 XL10, BL21(DE3)宿主菌为本试验室保
7、存. P1，P2 引物合成及序列测定由三博远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T ，EXTaq 聚合酶和连接试剂盒（宝航公司） ；逆转录试剂盒（Invitrogen 公司） ；JEV 鼠源性 mAb和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland 公司） ；红外成像系统（LICOR 公司） ；高速低温离心机（BECKMAN 公司） ；恒温摇床（上海智城公司）. 1.2 方法 1.2.1 片段的扩增及表达载体的构建用 Trizol提取 JEV RNA，以 8 L RNA为模板,1 L P1为引物,1 L dNTP 65水浴 5 min,冰
8、浴 1 min, 2 L 10RT缓冲液,4 L 25 mmol/LMgCl2,1 L RNaseout Recombinant Inhibitor, 42水浴 2 min；加 1 L superscriptTM混匀；42水浴 50 s；70水浴 15 min；加 1 L RAaseH混匀；37水浴 20 min；将得到的产物进行 PCR扩增，5端引物：5CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3 ；3端引物：5CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC3. 反应条件为：94 5 min，94 50 s；55 1 min；72 1 m
9、in 30 s, 30个循环，72 15 min.10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收目的片段. 将回收的 PCR产物克隆入 PMD18T 载体中转化 Ecoli E.XL10 感受态细胞，EcoR和 Xhol酶切鉴定，阳性克隆送公司测序；测序正确后，EcoR和 Xhol双酶切 PMD18TE 质粒和表达载体 pET28a,回收目的片段,连接；转 Ecoli E.XL10 感受态细胞；挑克隆；提取质粒；酶切鉴定载体构建. 阳性克隆质粒转化表达宿主菌 BL21(DE3)；提取质粒；酶切鉴定；阳性克隆保留菌种. 1.2.2 工程菌的诱导表达及可溶性分析用载体构建成功的菌种划抗性平板，挑取单
10、克隆在 37培养至 A600 nm为 0.40.6，加入 100 mg/L IPTG诱导 4 h. 1000 r/min, 4 10 min离心收菌. 弃上清后用 PBS洗菌体，用去离子水重悬菌体. 加入 2SDS上样缓冲液进行样品处理. 另离心收集菌体，以溶液 STE(50 mmol/L TrisCl (pH 8.0) ,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)重悬菌体，超声破菌（间隔 10 s,超声 8 s,共15 min）. 分别收集上清和沉淀，上清用 5SDS上样缓冲液处理，沉淀用 1SDS上样缓冲液处理后彻底重悬. 取上述各样品做 SDSPAGE 用2.5 g/
11、L考马斯 R25 溶液室温染色 2 h后脱色. 1.2.3 重组蛋白的鉴定同上取上清和沉淀样品分别进行处理并做SDSPAGE ，随后将电泳蛋白转移到 NC膜上（转移缓冲液：甘氨酸 39 mmol/L,Tris碱 48 mmol/L,SDS 3.7 mg/L,甲醇 200 ml/L） ，100 V转移80 min 后用 25 mmol/L TBS平衡 NC膜 10 min,用 0.5 g/L的脱脂奶 4封闭 5 h ，用 TBST洗膜 3次,10 min/次，1200 稀释 JEV鼠源性mAb，1100 稀释 JEV兔源性多抗，4孵育过夜，然后用 TBST洗膜 3次，10 min/次，再与 12
12、500 稀释的猴抗鼠抗体和羊抗兔抗体分别孵育，4作用 90 min后洗膜 3次，10 min/次，然后进行扫描分析. 1.2.4 重组蛋白的纯化参照 Qiagen公司镍离子亲和层析柱（NiNTA ）操作说明进行. 离心收集 500 mL诱导宿主菌，冰浴 15 min；按 5 mL/g湿菌的比例加入含 8 mol/L尿素的缓冲液 B(pH 8.0),室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4, 8563 g离心收集上清，弃去沉淀；将 500 mL/L的 NiNTA 树脂悬浮液 1 mL与一定量的清亮裂解上清于室温轻柔混匀（100 r/min摇动 60 min）后，将混合液装柱；收集穿过峰，留小样进行
13、 SDSPAGE ；然后用缓冲液 W(20 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗柱，再用缓冲液 E(250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脱，收集洗脱液. 取不同峰值样品进行 SDSPAGE 分析. 2 结果 2.1 重组表达载体的构建阳性重组质粒酶切产物在大小约 1500 bp处出现条带（图 1） ，与预期大小相符. 序列测定结果有三个碱基突变（第30位碱基 C突变为 T，第 705位碱基 A突变为 G，第 1298位碱基 T突变为 A） ，皆为无意义突变. M: DL2000 DNA marker; 1: 空 pET28a; 2: pET28aE 双酶切产物. 图 1pET28aE 的酶
14、切鉴定（略） 2.2 融和蛋白 E的表达与溶解形式的分析经 SDSPAGE 检测，在 Mr约 53 000处有明显的条带，与预期的 6HisE 融和蛋白大小一致. 融和蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中，但上清中也有少量的诱导表达的融和蛋白. 薄层扫描显示其占菌体总蛋白的 40%（图 2）. M: 标准蛋白质 marker; 1: 空 pET28a未诱导细胞; 2: 空 pET28a诱导细胞; 3: 重组载体 pET28aE 未秀导细胞; 4: 重组载体 pET28aE诱导细胞; 5: 重组载体 pET28aE 诱导细胞裂解上清; 6: 重组载体pET28aE 诱导细胞裂解沉淀. 图 2E蛋白的
15、表达及可溶性分析（略） 2.3 融和蛋白 E的大量表达及纯化利用 NiNTA agarose 柱通过金属螯合亲和层析进行纯化，从大肠杆菌 BL21(DE3)表达菌体的沉淀中变性、纯化得到 6His E融合蛋白. 纯化的蛋白经 PEG4000浓缩后经透析除去尿素，应用紫外光吸收法定量分析表明获得蛋白的浓度约为 0.759 g/L（图 3）. 2.4E 蛋白的 Western Blotting用 Odyssey扫描，在预期大小处可见清晰条带，提示纯化的 E蛋白较好地保持了与抗 JEV的多抗和单抗的结合活性（图 4,5）. M: 标准蛋白质 marker. 1: 空 pET28a未诱导细胞; 2:
16、空 pET28a诱导细胞; 3: 重组载体 pET28aE 诱导细胞裂解上清; 4: 重组载体pET28aE 诱导细胞裂解沉淀; 59: 纯化的融和蛋白. 图 36HisE 蛋白的纯化（略） 1, 2: pET28aE 诱导细胞; 3: pET28aE 未诱导的细胞; 4: 空pET28a诱导的细胞; 5: 空 pET28a未诱导的细胞. 图 4融合蛋白 6HisE 的 JEV多抗 Western Blotting鉴定（略） 1, 2: pET28aE 诱导细胞; 3: pET28aE 未诱导的细胞. 图 5融和蛋白 6HisE 的 JEV mAb Western Blotting分析（略）
17、3 讨论 JEV 与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV） 、登革病毒（Dengue virus, DV）同属黄病科黄病毒属成员3 ，其 E蛋白有着与 JEV E 蛋白有着相似的结构和功能，例如它们都有着三个结构域，即,2，4. 蛋白结构域主要承担着整个蛋白结构的形成；结构域包含一个融合环，推测其与病毒与宿主细胞的膜融合有关；而结构域则被认为是病毒与宿主细胞受体结构的部位2，5. Chu等4用 WNV E 蛋白结构域蛋白不仅能抑制 WNV对 C6/36细胞、Vero细胞的侵入，还能够抑制 DV2 对这两种细胞的入侵. 作为同属病毒它们有着很相似的结构和交叉的功能，但它们又有着种
18、的特异性. 例如，研究已证明 WNV E蛋白是三聚体，而不是像 DV E 蛋白是二聚体，并且揭示和分析了 WNV E蛋白的表位抗原位点3 ，揭示了 DV2 型 E 蛋白晶体结构，明确了 DV2 E 蛋白各区的功能4. 另外，已有报道用黄病毒科的其他病毒的 E蛋白和 E蛋白区蛋白成功的筛选到受体蛋白或受体复合物6-8. 目前 JE仍然威胁着人类的健康，在亚洲国家每年仍有 JE 50 000例，其中有 10 000例死亡9. 然而关于 JEV的致病机制到目前为止仍不明确. JEV的 E蛋白在病毒与敏感细胞结合过程中起着重要的作用，JEV敏感细胞表面有病毒的相应受体，但其性质和结构尚未明确. 由于
19、E蛋白的真核表达糖基化过多，严重影响了 E蛋白的生物学活性，我们力图用原核表达系统表达 E蛋白，在多次尝试不同表达载体与宿主菌之后，成功的构建了 E蛋白的原核表达载体. 对原核表达产物的可溶性分析结果表明，表达的 E蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体裂解后的沉淀中（占表达总量的 95%左右）. 表达的 E蛋白经纯化后用 SDSPAGE 和 Western Blotting鉴定，结果表明其 Mr大约为 53 000,与预期大小一致；表达的 E蛋白均能与 JEV的单抗和多抗结合，表明其具有较好的反应原性. 实验中观察到 E蛋白与多抗的结合要强于与单抗的结合，分析其原因，可能是由于多抗所针对的抗原表位
20、多，而单抗只针对单一抗原表位，因此蛋白与单抗的结合受到一定影响. 基金项目：国家自然科学基金（30400378） 【参考文献】 1 冯国和,窦晓光 ,王玉梅，等. 流行性乙型脑炎 DNA 疫苗研究新进展J. 国外医学流行病学传染病学分册，2005,(32):368-370. 2 Lin CW, Wu SC. A functional epitope determinant on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizingantibody combining
21、 sites J. J Virol, 2003,77(4):2600-2606. 3 Kanai R, Kar K, Anthony K, et al. Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes J. J Virol, 2006,80(22):11000-11008. 4 Chu JJ, Rajamanonmani R, Li J, et al. Inhibition of West Nile virus entry by using a recombina
22、nt domain from the envelope glycoprotein J. J Gen Virol. 2005;86(Pt 2):405-412. 5 Modis Y, Ogata S, Clements D, et al. A ligandbinding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein J. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12):6986-6991. 6 ReyesDel Valle J, ChavezSalinas S, Medina F, et al. Heat shock
23、protein 90 and heat shock protein 70 are components of Dengue virus receptor complex in human cells J. J Virol, 2005,9(8):4557-4567. 7 Chu JJ, Leong PW, Ng ML. Charaterization of plasma membraneassociated proteins from Aedes albopictus mosquito(C6/36) cells that mediate West Nile virus binding and i
24、nfection J. Virology, 2005,339(2):249-260. 8 Reyesdel Valle J, del Angel RM. Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography using a recombinant E protein ligand J. J Virol Methods, 2004,116(1):95-102. 9 Lin CW, Lin KH, Lyu PC, et al. Japanese encephalitis virus NS2BNS3 protease binding to phagedisplayed human brain proteins with the domain of trypsin inhibitor and basic region leucine zipper J. J Virus Res, 2006,116(12):106-113.
