1、中国汉族原发性闭角型青光眼大家系临床资料总结及 TIGR 基因第三外显子突变筛查【摘要】 目的 总结一中国汉族原发性闭角型青光眼大家系临床表型特点及遗传模式，并筛查在该家系成员中是否存在 TIGR/MYOC 基因第三外显子突变。方法 对该家系家庭成员进行眼科检查，包括视力、屈光检查、Goldmann 压平眼压计测量眼压、房角镜检查、自动视野检查以及眼球 A 超检查。应用聚合酶链反应（PCR）扩增 22 名家系成员 TIGR 基因第三外显子，并对 PCR 产物进行测序分析。结果 原发性闭角型青光眼在此家族中呈常染色体显性遗传模式，其临床表型为慢性闭角型青光眼。与第 6 代成员相比，第 4 代及第
2、 5 代成员的眼轴及前房较短，晶状体较厚。第 4 代成员的平均屈光状态为远视，第 5 代为正视，第 6 代为近视，但第 6 代中仍有一名成员为远视。家族的 22 名成员中未检测到 TIGR 基因第三外显子突变或单核苷酸多态性（SNP） 。结论 在此中国汉族常染色体显性遗传原发性闭角型青光眼大家系中排除了 TIGR 基因第三外显子突变与青光眼发病之间的关系。 【关键词】 原发性闭角型青光眼 家系 TIGR 基因 中国人 Abstract: Objective To identify the hereditary mode and clinical features of the disease
3、in a Chinese primary angle closure glaucoma (PACG) pedigree of the Han nationality and to screen the existence of exon 3 mutation of TIGR genes in this family. Methods A Chinese 7-generation PACG pedigree was enrolled in this study. The ophthalmologic examinations consisted of evaluation of visual a
4、cuity, refraction, Goldmann applanation tonometry, gonioscopy, automatic visual field test and A ultrasonography. The coding sequence of exon 3 of the TIGR gene was extended to 22 family members by polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA, followed by sequencing of the PCR products. Results
5、 The pedigree exhibited an autosomal dominant pattern of inheritance of PACG. The clinical features of PACG in this pedigree can be classified as chronic angle closure glaucoma. Relatively shorter axial length and anterior chamber depth with thicker lens were observed in the generations and than in
6、the generation . The mean refraction status changed from hyperopic in generation to emmetropia in generation , while in generation , the mean refraction status was myopic, but still, there was one member in generation was hyperopic. Neither mutation nor SNP in exon 3 of the TIGR gene was detected in
7、 this pedigree. Conclusion The results of this study do not support a role of mutation in exon 3 of the TIGR gene in the pathogenesis of PACG inherited with an autosomal dominant pattern in this Chinese pedigree. Key words: primary angle closure glaucoma; pedigree; TIGR gene; Chinese 在原发性闭角型青光眼患者及其家
8、属中常可观察到眼前段结构的拥挤现象。在因纽特人中，原发性闭角型青光眼患者的一级亲属发病率比一般人群高 3.5 倍1 ，中国原发性闭角型青光眼患者的家族成员发病率则比一般人群高 6 倍2 。Trnquist 3在 1953 年首先提出存在一个原发性闭角型青光眼显性基因，但至今为止仍未发现原发性闭角型青光眼疾病基因或与之相关的候选基因位点。有关原发性开角型青光眼的分子遗传学研究则已明确了 15 个与开角型青光眼相关的基因位点，此外还有 7 个与其他类型青光眼致病相关的疾病基因也得到确认4 。其中小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白（TIGR）基因，也称为 MYOC 基因。TIGR 基因是目前为止研究最多的
9、原发性开角型青光眼疾病基因5 ，在白人、亚裔人及非洲裔人中均发现了致病碱基改变，其中 3%5% 的成年性开角型青光眼患者存在该基因突变，而在青少年性开角型青光眼患者中其突变率为 8%36%。目前已报道的突变基因有 70 个，绝大部分致病突变基因位于第三外显子区域，与青少年性青光眼相关的突变基因则全部位于第三外显子与嗅球蛋白高度同源的片段6-8 。 在近年来针对加拿大青光眼人群的基因型及表现型的研究中，发现在原发性闭角型青光眼患者中亦存在 TIGR 基因突变，Pro481Leu、Glu368STOP、Gly399Val 均位于第三外显子区域，证明原发性闭角型青光眼患者也可携带 TIGR 基因突变
10、。我们从 2004 年开始对一个连续 7 代患有原发性闭角型青光眼的家系进行了定期随访，我们认为在进行其他候选基因筛查及全基因组扫描前有必要首先筛查 TIGR 基因第三外显子，从基因学上确认所研究的家系属原发性闭角型青光眼家系。 1 资料和方法 1.1 一般资料 该原发性闭角型青光眼家系成员大部分居住于中国南部偏僻山区农村，该家族所有成员均为汉族且无近亲结婚史。家族中22 名成员纳入本研究并在北京大学深圳医院眼科接受检查。所有参与此项研究的患者均签署了知情同意书，研究计划亦通过了医院道德委员会审批。 1.2 家系研究方法 眼科检查包括：视力及校正视力，屈光状态，眼前节裂隙灯显微镜检查，Gold
11、mann 压平眼压计测眼压，房角镜检查，眼底检查（90 D 前置镜及检眼镜检查） ，自动视野计检查（Humphery field analyzer）,A 型超声检查（Alcon Biophysic, OcuScan, Version 3.02） 。所有家系成员（1 因只有 5 岁故未接受检查）均接受以上检查，家系成员的疾病诊断及排除均由 2 名青光眼专业医师确认。其他信息如既往眼压及降眼压治疗或其他治疗、激光手术或其他抗青光眼手术史等也一并记录于档案中。 1.3 原发性闭角型青光眼诊断标准 青光眼性视盘改变，存在盘沿组织的缺失；青光眼性视野改变，且与盘沿组织缺失相一致；动态房角镜检查见房角关闭
12、。对于存在上述诊断标准第 3 条但未见青光眼性视盘及视野改变的诊断为可疑原发性闭角型青光眼。已死亡患者的诊断根据其病史及手术记录。家系成员的精神疾病诊断依据其病史。 1.4 实验方法 抽取 2 名家系成员外周静脉血，采用 TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生物有限公司)从 300 l 全血中抽提基因组DNA，采用 PCR 方法扩增涵盖 TIGR 基因第三外显子的 927 bp 的片断，正向及反向引物分别为:5-GCTGTCACATCTACTGGCTC-3和 5-ATCTCCTTCTGCCATTGCCT-3。 反应体系为 50 l，其中包括 100 ng 基因组 DNA，5
13、 l 10pfu 缓冲剂，4 l 25 mol/L Mg2+，1.2 l 10 mol/L 引物，1 l 10 mmol/L dNTP，及 1.25 U pfu DNA 聚合酶(MBI，Lithuania)。PCR 反应程序为： 95变性 2 min；随后 35 个循环，包括 95变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 2 min；最后 72延伸 5 min 完成全部过程。 PCR 产物长度为 927 bp，以 1.5%琼脂糖凝胶电泳进行产物分析，以紫外线凝胶照相系统（BIO-RAD 公司）记录结果。只有结果显示无非特异性扩增的产物在进一步纯化（DNA Gel Extraction Ki
14、t，上海晶泰生物技术有限公司)后进行 DNA 双向测序。 双向测序所使用的引物为 5-ACTGGCTCTGCCAAGCTTCC-3及 5-GCTGAATACCGAGACAGTGA-3, 使用仪器为 Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (ABI 公司)，并使用其附带软件 Sequencing Analysis Software 5.2.0 进行分析。 2 结 果 2.1 家系中原发性闭角型青光眼表型总结 该原发性闭角型青光眼家系为 7 代，原发性闭角型青光眼为显性遗传。纳入研究的 22 名成员中，4 人确诊为原发性闭角型青光眼，2 人为可疑原发性闭角型青光眼
15、，1 人因具有青光眼神经病变以及青光眼性视野改变，房角镜下房角为开角且年龄为 30 岁而诊断为青少年性开角型青光眼（图 1） 。 该家系中原发性闭角型青光眼发病年龄在 3050 岁。先证者在 40岁确诊患有原发性闭角型青光眼并在中山医科大学附属眼科医院接受了双眼小梁切除手术，术后没有接受降眼压药物治疗，眼压一直保持正常水平，直至 80 岁。12 亦接受了双眼小梁切除手术，术后同样不需加用抗青光眼药物治疗。15 因患有精神病而未接受过任何药物或手术治疗，该名患者具有典型青光眼视神经病变及严重视野缺损，但因患有抑郁症仍拒绝任何治疗。11 接受抗青光眼药物治疗但拒绝任何形式的抗青光眼手术治疗。 该家
16、系中原发性闭角型青光眼的临床表型特点为：发病年龄为3050 岁；周边前房关闭形态为锥状粘连或堤状粘连并逐渐扩大；房角逐渐关闭，青光眼损害隐匿，急性或亚急性发作前可无任何症状；周边前房浅，中央前房无明显异常；抗青光眼手术降眼压效果明显。家系成员眼球生物测量数据见表 1。表 1 第 4、5、6 代患者的屈光度及眼球 A 超测量结果 2.2 家系成员 TIGR 基因第三外显子筛查结果 在原发性闭角型青光眼家系的 22 个成员中，未发现 TIGR 基因的第三外显子出现任何碱基改变，包括其中 1 名青少年性开角型青光眼患者。说明 TIGR 基因突变未参与该家系中青光眼的发病机制；而其他同时研究的青少年开
17、角型青光眼家系中的患者均携带特定 TIGR 第三外显子的突变。 3 讨 论 该家系中原发性闭角型青光眼属慢性闭角型青光眼。通常慢性闭角型青光眼可表现浅前房、高眼压但没有房角粘连；或眼压正常，房角粘连及房角关闭。此外慢性闭角型青光眼还包括混合机制性青光眼、高褶虹膜型青光眼以及由长期使用散瞳药物引起的闭角型青光眼，这些均非该家系中闭角型青光眼的临床类型。 已有研究表明，闭角型青光眼患者的眼前节具有特殊的解剖特征，包括较浅的前房、较厚的晶状体以及较短的眼轴，并且这类患者通常还患有远视眼。参与本研究的闭角型青光眼家族的第 4 以及第 5 代成员与第 6 代成员相比较，均表现出较短的眼轴、较浅前房以及较
18、厚的晶状体，第 4 代与第 5 代成员中患有原发性闭角型青光眼的人数较第 6 代多。第4 代的平均屈光状态为远视，第 5 代为正视，到第 6 代则为近视，但第 6代中仍有 1 名成员为远视及弱视（14） 。对这些家族成员均应进行定期严密随访以及时发现异常情况以免延误诊断。 在此家族中原发性闭角型青光眼表现为常染色体显性遗传，但所有患者的 TIGR 基因第三外显子均未发现突变或单核苷酸多态性（SNP） ，包括在编号为19 的青少年性开角型青光眼患者亦未发现基因序列的变化。本研究结果表明此家族的原发性闭角型青光眼发病与 TIGR 基因第三外显子突变不相关。一项以 106 名散发中国慢性闭角型青光眼
19、患者为对象的研究显示，该人群中出现了 TIGR 基因的 8 个序列改变，其中包括以往研究报道的 Arg46Stop 与 Thr353Ile 突变9 ，但这些改变同样出现在正常中国人群中。另外一项以台湾人群为对象的研究显示，位于 MMP9基因区域的基因单核苷酸多态性 rs2664538 与闭角型青光眼发病密切相关10 。 原发性闭角型青光眼发病的分子遗传学机制至今尚未清楚，这可能是由于对患者家族史缺乏收集及整理，只把每个患者当做独立个体诊断，从而失去了进行遗传学研究的资料11 。此外该病发病年龄较大，并且缺乏关于前代患者准确的临床资料，这都成为了研究原发性闭角型青光眼遗传特性的绊脚石9 。 由于
20、原发性闭角型青光眼与疾病相关的解剖基础集中于眼前节，因此与眼前节发育相关的基因 PAX6 基因12-14可能在原发性闭角型青光眼的发病机制中起到重要的作用。因此，我们将在后续研究中对该家系成员进行与眼前房发育相关基因的筛查分析，并最终进行全基因组扫描，这将有助于揭示原发性闭角型青光眼发病机制的分子遗传学基础。 【参考文献】 1 Sim DH, Goh LG, Ho T. Glaucoma pattern amongst the elderly Chinese in Singapore J. Ann Acad Med Singapore,1998,27(6):819-823. 2 Wang RR
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