1、中药复方红苓肝宝对酒精致小鼠骨丢失的预防作用作者：陈艳 吴铁 廖进民 黄连芳【摘要】 目的观察中药复方红苓肝宝对酒精致小鼠骨丢失的预防作用。方法昆明种小鼠 50 只随机分组，除对照组外，各组予 50%（V/V）酒精按 4 gkg-1d-1 灌胃，药物预防组分别在酒精灌胃前给予中药低剂量（HLGB-L） ，高剂量（HLGB-H）和西药对照，60 d 后处死取左侧胫骨上段不脱钙骨切片进行骨组织形态计量学参数测量，腰椎及股骨测定骨生物力学指标。结果酒精组小鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar）明显降低(-66%，P0.05)，骨形成率（BFR/TV）降低（-35%,P0.05） ；腰椎抗压性能和股骨颈结
2、构强度均明显下降。与酒精组比较，HLGB-H 组%Tb.Ar 增加（+68%,P0.05） ，BFR/TV 增加(+42%，P0.05)，腰椎抗压性能和股骨颈结构强度增加（分别为+50%，+13%, P0.05） ，与低剂量组比有统计学差异，但没达到正常组的水平。结论 HLGB-H 对酒精摄入造成的小鼠骨丢失有一定的预防作用，不但增加其骨量，改善骨的微观结构，还增强骨的力学性能，但不能完全恢复至正常小鼠的水平。 【关键词】 红苓肝宝； 酒精致骨丢失； 骨组织形态计量学； 骨生物力学； 小鼠Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of
3、Hongling Ganbao(HLGB) on bone loss induced by alcohol in mice.MethodsFifty six-week-old KM mice, were randomly divided into 5 groups except for the control group. 50%(V/V) alcohol was given to the model mice according to the dosage of 4g/（kgd).Low dose（HLGB-L）and high dose of HLGB（HLGB-H）were given
4、to mice respectively before the alcohol was consumed in preventive groups. After 60 days, all mice were killed and their left tibial metaphysis were processed in undecalcified sections for bone histomorphometric analysis. The tested biomechanical properties of vertebra and femccr were tested. Result
5、sCompared with normal group, cancellous bone area (%Tb.Ar) was decreased obviously(-66%) in alcohol group, bone formation rate BFR/TV was decreased（-35%, P0.05） （and bone resorption parameter Oc.N/Tb.Pm tended to increase）, bone biomechanics properties of femur were decreased significantly. Compared
6、 with alcohol group, indexes of %Tb.Ar and BFR/TV of HLGB-H group were increased(+68%,+42%respectively), and bone biomechanics properties including compressive resistibility of vetebra and structure strength of femur neck both improved significantly. There had statistical significance between TCMC a
7、nd HLGB-L, but it didnt reach the normal level. ConclusionHLGB-H could prevent bone loss induced by alcohol by improving bone microstructure and strengthening bone biomechanics properties.Key words：Alcohol; Hongling Ganbao; Bone histomorphometry; Bone biomechanics; Mice饮酒是严重的公共卫生问题，酒精干扰骨代谢、甚至引起骨量丢失、
8、骨质疏松等不利作用一直以来未得到足够重视1 。有证据表明，长期饮酒即使是中等剂量（3050 g/d） ，也是骨质疏松的危险因素之一2 ，因此对于酒精性骨质疏松症的防治就显得极为必要。本课题组自行研制的一种中药复方（已获得国家发明专利，专利号：ZL00128705.2）是由红花、茯苓、甘草、红枣 4 种药食两用的中药组成，其中多种成分均有提高机体的免疫能力及解毒作用。本实验通过骨组织形态计量学结合骨生物力学方法，探讨中药复方红苓肝宝对酒精致骨丢失的预防作用及其作用机制。1 材料1.1 药物无水乙醇，批号 2004042601，广州化学试剂二厂产品，100%分析纯，加蒸馏水配制成 50（V/V）的
9、酒精溶液；阿伦膦酸钠（固邦） ，10 mg/片，石家庄制药集团有限公司产品，批号 031201；特乐定（每片含有效成分 134.4 mg） ，罗达研究实验室股份有限公司产品，批号020101；中药复方红苓肝宝由红花、茯苓、甘草、红枣 4 种药食两用的中药组成复方，浓缩至含生药 2 g/ml，由本校开发中心药厂提供。1.2 动物及分组 清洁级 6 周龄昆明种小鼠 50 只，体重 2535 g，雌雄各半，由本院实验动物中心提供。随机分成 5 组，正常对照组以蒸馏水 10 ml/kg 每日灌胃；酒精组（模型组） ，红苓肝宝低剂量组（HLGB -L） ，高剂量组（HLGB-H） ，50酒精按剂量 4
10、gkgd-1 灌胃，中药组在给予酒精溶液前 2 h 分别给予红苓肝宝水提液 5，15 gkg-1d-1；固邦+特乐定+酒精组：固邦 1.5 mgkg-1d-1，特乐定 7.84 mgkg-1d-1，均按 0.1 ml/10 g 灌胃，间段单独给药，如第 1 个星期给固邦，第 2 个星期就给特乐定,给予药物 2 h 后给予酒精。所有小鼠自由摄水、摄食，每周称体重 2 次，根据体重调整用药量，共 60 d。2 方法2.1 检测方法及观察指标 处死后取一侧胫骨经低速锯暴露骨髓腔，上段进行不脱钙骨包埋，并分别切成 5 m 和 10 m 的骨片。薄片Goldner 染色后测量破骨细胞，厚片直接封片后经骨
11、组织形态计量学软件测量骨代谢相关指标，其测算参数及含义参见文献3 。骨生物力学测定：将保存的腰椎和股骨经材料测试系统（MTS 858 Mini Bionix 型,USA）检测和分析其生物力学性能（由南方医科大学生物力学国家重点实验室协助完成） ，腰椎进行凹入实验，股骨颈进行侧摔实验。2.2 统计分析 采用统计学软件 SPSS 11.0 进行方差分析，再进行组间两两比较。3 结果3.1 乙醇对生长期小鼠骨代谢的影响结果见表 1。与正常组相比，酒精组的各参数值骨小梁面积百分率（%Tb.Ar） ，骨小梁数量(Tb.N)，荧光周长（L.Pm） ，骨形成率(BFR/TV)等均明显降低。骨小梁分离度（Tb
12、、Sp）增加。骨吸收参数单位骨小梁周长破骨细胞数（Oc.N/Tb.Pm）各组间没有统计学差异。HLGB-L 与酒精组相比没有明显差异，HLGB-H 与酒精组和低剂量组比较，各参数值均有显著差异，与阳性药物组的效果相当，但%Tb.Ar 没有达到正常组的水平。表 1 乙醇对小鼠胫骨上段松质骨的影响与正常组比较，*P0.05, *P0.01；与酒精组比较，#P0.05，#P0.01；与 HLGB-L 比较，P0.05，P0.013.2 乙醇对小鼠腰椎抗压性能及股骨颈结构强度的影响 见表2。表 2 乙醇对小鼠腰椎抗压性能及股骨颈结构强度的影响与正常组比较，*P0.05, *P0.01；与酒精组比较，#
13、P0.05；与 HLGB-L比较，P0.05酒精组各指标值均有下降，HLGB-L 与酒精模型组没有改善，HLGB-H 与酒精组和低剂量组比较，各参数值均有显著差异，与阳性药物组的效果相当，但没有达到正常组的水平。4 讨论骨组织形态计量学可直接观察骨组织的微观形态并进行定量分析，骨生物力学指标则有助于对骨质量进行直接评价，两者结合可对骨的“质”和“量”进行综合的评价。椎体凹入实验主要用于测量松质骨的生物力学强度，敏感性相对较高，能表示抵抗外力的最大载荷4 。股骨颈侧摔实验是一种模拟人的股骨颈骨折的发生机制而进行的实验方法，能更真实地反映外力作用于标本造成骨折时的骨力学特性。本实验中由松质骨的形态
14、计量参数可知道，喂食酒精的小鼠，松质骨骨量减少，骨的微观结构变差：骨小梁稀疏，变细。动态参数的结果可以解释主要是因为骨形成率的下降而导致骨量的减少。生物力学指标腰椎抗压性能和股骨颈结构强度均明显下降，说明小鼠已经出现骨质疏松的表现，骨质量下降。乙醇对骨的影响的机制研究目前认为主要是由于酒精中的乙醇及其代谢产物对成骨细胞的直接毒性作用,实验表明酒精抑制成骨细胞的活性和增殖，抑制其前体细胞的形成5 ；近年来更深入的研究发现，乙醇抑制骨髓间叶干细胞的分化，下调胶原 I 的基因表达，减少其分泌并抑制矿化结节形成；还可诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，减少向成骨细胞分化6 ，最终导致骨形成率降低。酒精对骨
15、吸收也有影响，有报道称酒精可能是通过 IL-6 介导增加核因子 kB 受体活化因子配体（RNAKL）mRNA 的表达，从而促进骨吸收，加速骨丢失。给予中药复方红苓肝宝预防的小鼠，动静态参数都有改善，松质骨骨量增加，微观结构改善，骨形成率增加，红苓肝宝高剂量的效果明显，低剂量完全没有预防骨力学性能下降的作用，高剂量则可明显提高骨力学性能的两项指标，与西药对照组的效果相当，但都没有达到正常组的水平。说明红苓肝宝对酒精造成的骨量丢失有一定的预防作用。红苓肝宝的组方中，红花能活血通经，散瘀止痛，提高机体免疫功能以及抗炎作用，改善骨骼局部血液循环，茯苓中的三萜类有效成分据研究有利尿，增强免疫功能和保肝降
16、酶作用7 ，大枣中的磷酸腺苷，甘草中的甘草酸都具有保肝护肝作用8 ，中药复方可能发挥协同作用，增强机体免疫能力，并增强肝脏清除乙醇的能力，减少对骨骼的损害，这可能是红苓肝宝发挥预防作用的主要原因。由于不能直接对抗乙醇对成骨细胞的作用，所以不能完全阻止骨量的丢失及骨力学性能的下降。综上所述，酒精摄入能造成生长期小鼠的骨质量下降，中药红苓肝宝有一定的预防作用，但不能完全阻止酒精对小鼠骨量和力学性能的不利影响。【参考文献】1 Turner RT. Skeletal response to alcoholJ. Alcohol Clin Exp Res, 2000, 24(11) ：1693.2 Tur
17、ner RT, Kidder LS, Kennedy A.Moderate alcohol consumption suppresses bone turnover in adult female ratsJ. J Bone Miner Res，2001，16（3） ：589.3 李青南.骨质疏松实验动物研究-骨组织形态计量学M.成都：四川大学出版社，2001:41.4 郭玉明,贾潇凌国人胫骨松质骨力学性质的实验研究J.中国生物医学工程学报，1999,18（3）:250.5 Giuliani N, Girasole G, Vescovi PP, et al. Ethanol and aceta
18、ldehyde inhibit the formation of early osteoblast progenitors in murine and human bone marrow culturesJ. Alcohol Clin Exp Res, 1999，23:381.6 李 杰，李月白，王义生，等.酒精对骨髓基质细胞成脂与成骨分化的影响J.中华骨科杂志，2003，23（8）:493.7 张思访，刘静涵，蒋建勤，等.茯苓的化学成分和药理作用及开发利用J.中华实用中西医杂志，2005，18（2）：227.8 田庆来，官月平，张 波，等.甘草有效成分的药理作用研究进展J.天然产物研究与开发，2006，18（1）：343.
