1、滋补肝肾、通络解毒中药对异动症大鼠行为学及纹状体多巴胺 D2 受体活性的影响【摘要】 观察滋补肝肾、通络解毒中药对异动症大鼠行为学和多巴胺 D2 受体活性的影响。 方法：采用 6 羟基多巴胺（6hydroxydopamine ，6OHDA ）注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病（Parkinsons disease，PD）模型，进一步对 PD 大鼠予以左旋多巴/苄丝肼制作异动症(levodopainduced dyskinesias，LID)模型。实验设立正常对照组、模型组、中药干预组、中止给药对照组和中止给药中药干预组，观察中药对 LID 大鼠异常不自主运动（abnormal involun
2、tary movement, AIM）评分的影响，测定大鼠纹状体多巴胺 D2受体的最大结合容量（maximum binding capacity，Bmax）和平衡解离常数（equilibrium dissociation constant, KD） ，来评价中药对 LID大鼠多巴胺 D2 受体亲和力的影响。结果：与模型组和中止给药对照组比较，中药干预组可明显减少异动症大鼠的 AIM 积分（P0.01） ；纹状体多巴胺 D2 受体亲和力检查示，中药可使 Bmax 显著上调（P0.05，P0.01） ，KD 值下降（P0.01） ，多巴胺 D2 受体亲和力显著提高。结论：滋补肝肾、通络解毒中药可以
3、有效缓解异动症症状，明显改善纹状体多巴胺 D2 受体活性。 【关键词】 异动症 中药 多巴胺 D2 受体 神经行为学表现 大鼠Objective: To explore the effect of traditional Chinese herbal medicine (TCM) for nourishing liver and kidney, clearing meridians and removing toxic substances, on the neurobehavioral manifestations and the activity of the dopamine D2 re
4、ceptor in rat with levodopainduced dyskinesias (LID).Methods: The rat model of Parkinsons disease (PD) was established by injecting 6hydroxydopamine (6OHDA) into right substantia nigra of brain, then, the model of LID in rat was produced by injecting levodopa (LD) and benserazide for 4 weeks. The ra
5、ts were divided into normal control group, 4week LD treated group, 4week LD plus TCM treated group, 8week LD treated group, and 8week LD plus TCM treated group, and the effect of the TCM on neurobehavioral manifestations was observed. The radioligand binding assay (RLBA) and Scatchard drawing were u
6、sed to measure the maximal binding capacity of receptor (Bmax) and equilibrium dissociation constant (KD) of the dopamine D2 receptor in corpora striatum.Results: Compared with the 4week LD treated group and 8week LD treated group, TCM could decrease abnormal involuntary movement scores of the rats
7、with LID; the RLBA revealed that the dopamine D2 receptor Bmax significantly increased (P0.05, P0.01) and the KD significantly decreased (P0.05).Conclusion: TCM can improve the activity of the dopamine D2 receptor and relieve the symptoms of LID.Keywords: levodopainduced dyskinesias; traditional Chi
8、nese herbal medicine; dopamine D2 receptor; neurobehavioral manifestations; rats异动症（levodopainduced dyskinesias, LID）是左旋多巴（levodopa, LD）长期治疗帕金森病（Parkinsons disease，PD）过程中普遍出现的并发症，主要表现为舞蹈症和手足徐动症，严重影响帕金森病患者的日常生活质量。目前，各国学者在努力寻找 PD 病因的同时将研究重点集中在如下两方面：一是如何阻止或减缓黑质多巴胺能神经元的进行性变性；二是如何减少左旋多巴制剂毒副作用。本研究主要探讨滋补肝肾
9、、通络解毒中药对 LID 大鼠行为学和纹状体多巴胺 D2 受体数量及亲和力的影响。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验药物 滋补肝肾、通络解毒中药熟地平颤汤颗粒合用蝎蜈胶囊为上海市名中医胡建华教授经验总结方，熟地平颤汤颗粒由熟地黄 15 g、枸杞 15 g、桑寄生 20 g、天麻 15 g、僵蚕 10 g、莪术15 g、白芍药 20 g 和天南星 15 g 组成，由江阴天江药业有限公司制成颗粒剂（批号：0504312） ，每袋重 4.8 g，相当于生药 31.25 g。蝎蜈胶囊（批号：010813）按全蝎蜈蚣=11 配制，烘干打粉，灌制胶囊，每粒含生药 0.3 g。将 4 袋熟地平颤
10、汤颗粒和 10 粒蝎蜈胶囊（相当于成人1 d 用量，含生药 128 g）混合后溶于 100 ml 生理盐水中，使每毫升含生药 1.28 g。LD 粉剂 5 g（批号：SLD6382）和苄丝肼粉剂 5 g（批号：SL06492） ，由美国 Sigma 公司提供。1.1.2 主要试剂和仪器 6 羟基多巴胺（6hydroxydopamine ，6OHDA) 、阿朴吗啡（apomorphine，APO)和布他拉莫，美国 Sigma 公司产品；3H 螺环哌啶酮和闪烁液，美国PerkinElmer 公司产品。大鼠脑立体定位仪，TOW3A 型，第二军医大学产品；超速离心机，LE80K 型，Beckman 公
11、司产品；液体闪烁发光记数仪，Wallac1450 型，美国 PerkinElmer 公司产品。1.1.3 实验动物 成年雄性 SD 大鼠 30 只，体质量 180220 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供,动物许可证号为 SCXK 沪20030002 。1.2 实验方法1.2.1 PD 大鼠模型制备 PD 大鼠模型制备参照文献1方法，SD 大鼠用 1%戊巴比妥麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪上，参照包新民等2所著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNC)和中脑腹侧被盖部(ventral tegmental area，VTA
12、)三维坐标位置，SNC 为前囟后 4.8 mm、矢状缝右侧 2.0 mm、硬膜下 8.0 mm；VTA 为前囟后 4.8 mm，矢状缝右侧 1.2 mm，硬膜下 8.2 mm。牙科钻打孔，向两坐标点各注射 6OHDA 6 g（溶于含 0.2%抗坏血酸的生理盐水中，6OHDA 浓度为 2 g/L） ，注射速度为 1 l/min，留针 10 min。术后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，伤口上涂抹磺胺颗粒抗感染，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。术后 2 周腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg 体质量）诱发大鼠旋转，记录注射后 30 min内大鼠旋转方向和旋转圈数，若大鼠恒定转向右侧且旋转圈数
13、7 r/min 则视为 PD 模型成功。1.2.2 LID 大鼠模型制备 对成功的 PD 大鼠予左旋多巴/苄丝肼治疗（10 mg/ml 左旋多巴和 2.5 mg/ml 苄丝肼溶于含 0.2维生素 C 的消毒生理盐水中） ，制备 LID 大鼠模型3 ，左旋多巴的注射剂量为 10 mg/kg 体质量，每天 9 时和 17 时进行腹腔注射，持续 4 周。根据其是否出现刻板动作和对侧旋转行为等异常不自主运动（abnormal involuntary movement，AIM） ，筛选出 LID 模型，AIM 评分20 分则视为 LID 模型成功。1.2.3 动物分组及给药 左旋多巴用药 4 周后，将成
14、功建立的LID 模型大鼠，分为模型组(8 周模型组)、中药干预组、中止给药对照组(4 周模型组)、中止给药+中药干预组，每组 6 只，再另取 6 只未造模大鼠为正常对照组。正常对照组及中止给药对照组给予生理盐水灌胃，模型组继续予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射（注射剂量为 10 mg/kg） ，中药干预组在模型组处理基础上给予中药灌胃，中止给药+中药干预组则在 4周时停用左旋多巴/苄丝肼的基础上加用中药（同中药干预组） ，每次灌胃量为 9 ml/kg，1 次/d，连续 4 周。1.2.4 AIM 评分测定 除正常对照组大鼠外，模型各组大鼠于观察期间每周进行 AIM 评分，参照文献方法4 ，将 AIM
15、 分为 4 个部分（前肢 AIM、口面部 AIM、轴性 AIM 及运动 AIM）进行评定，每部分又根据其有无和严重程度划分为 5 个等级，计为 04 分，其中 0 分为无；1分为偶尔出现；2 分为经常出现；3 分为持续存在，刺激使之停止；4 分为持续存在，刺激也不能使之停止。理论上 1 只大鼠 1 次腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后的 AIM 最高评分为 64 分。评分在左旋多巴/苄丝肼腹腔注射后立即进行，30 min 评定 1 次，共 120 min，5 组数据平均值为本次的AIM 分数。1.2.5 膜蛋白制备 参照张旺明等5方法制备膜蛋白，大鼠以 10水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速断头取脑，于冰块
16、上分离并切取双侧尾壳核脑组织各 1 块。加入 4 预冷的 Tris 盐酸缓冲液，冰浴中制成匀浆，离心后，取沉淀以 Tris 盐酸缓冲液（pH 7.4）12 ml 稀释，充分混悬，即成膜蛋白悬液。以考马斯亮蓝法测定膜蛋白浓度，并用 Tris 盐酸缓冲液调整膜蛋白浓度为 1 g/L 左右。1.2.6 多巴胺 D2 受体活性的测定 采用双复管法（每个样本分为 9 个不同浓度反应管，重复测定 2 次）测定，反应管内加入浓度呈倍比递增的标记配基（特异性结合：10、20、40、60、80 和 100 l。非特异性结合：20、60 和 100 l）和非标记配基（非特异性结合：100 l)以及定量的膜蛋白液
17、0.2 ml，加入 Buffer 缓冲液，使每管总反应体积为 0.4 ml，37 水浴中孵育 15 min，于冰浴中终止反应。以多头细胞样品收集器收集于玻璃纤维滤纸上，置 80 烘箱中烤干，剪下样品，以 2000CA/LL 型液态闪烁计数仪测定其放射活性，以空白滤纸点样进行校正。计算各点特异性结合计数，使用受体数据软件包（上海第二医科大学编制） ，按 Scatchard 公式计算出多巴胺受体的最大结合容量（maximum binding capacity, Bmax）和平衡解离常数（equilibrium dissociation constant, KD） 。1.3 统计学方法 采用 SPS
18、S 13.0 统计软件包进行数据分析，采用单因素方差分析及 t 检验进行组间比较，结果用 xs 表示，检验水准=0.05。2 结 果2.1 各组大鼠给药前后 AIM 评分的变化 与用药前比较，模型组大鼠用药后第 1、2、3 和 4 周的 AIM 评分逐步增高（P0.01） 。与同期模型组比较，中药干预组大鼠第 1 周 AIM 评分差异无统计学意义，自第 2 周开始下降，第 3 和 4 周的 AIM 评分值低于同期模型组（P0.01） 。中止给药对照组大鼠第 2、3 和 4 周 AIM 评分低于模型组（P0.01） 。中止给药+中药干预组大鼠 AIM 评分各个时间点均低于同期中止给药对照组（P0
19、.01） 。见图 1。2.2 各组大鼠双侧尾壳核多巴胺 D2 受体活性 各组大鼠与正常对照组比较，损毁侧多巴胺 D2 受体 Bmax 显著降低（P0.01） ，模型组下降幅度较大；模型组和中止给药对照组大鼠多巴胺 D2 受体 KD 值升高（P0.01） 。中药干预组大鼠多巴胺 D2 受体 KD 值低于模型组（P0.01） ，Bmax 高于模型组（P0.01） ；中止给药+中药干预组与中止给药对照组比较，多巴胺 D2 受体 KD 值明显降低（P0.01） ，Bmax 升高（P0.05） 。见表 1。表 1 中药对异动症大鼠双侧尾壳核多巴胺 D2 受体活性的影响3 讨 论在 PD 的发病机制中不仅
20、由于脑中多巴胺神经元的减少，多巴胺能受体也起重要作用。多巴胺能受体分为 D1 和 D2 两族6 ，PD 的病理主要涉及的是 D2 的损害。LD 是临床上疗效较好的多巴类替代治疗药物，Ldopa 在体内转化为多巴胺后，多巴胺可通过自身氧化代谢生成具有细胞毒的的多巴醌和其他自由基。因此，LD 可能加速多巴胺神经元的变性，具有一定神经毒性。Nakao 等7提出纹状体神经元可将外源性多巴转换成多巴胺，增加的多巴胺作用于突触后多巴胺 D2 受体引起 D2 受体下调，使纹状体损毁侧与其健侧的 D2 受体表达数减少。Brooks 等8运用正电子发射断层照相术（positron emission tomogr
21、aphy，PET）和多巴胺 D2 受体 PET 显像剂 11C 雷氯必利研究比较了早期和晚期对多巴胺制剂反应波动的 PD 患者的 D2 受体，结果发现前者基底节 D2 受体放射性结合率正常或增高，而后者则明显下降（尾核、壳核部分分别下降 30和 18） 。结合本实验结果，异动症大鼠随着 LD 腹腔注射时间的延长，异动症症状愈发加重，纹状体 D2 受体亲和力明显下降，健侧亲和力也有下降。我们认为 LD 虽然能明显改善 PD 的症状，但 LD 治疗能使纹状体多巴胺 D2受体下调，D2 受体下调到一定阈值可能为 LD 长期治疗后引起疗效减退的原因。本次实验从异动症行为学检测可以发现，从第 0 周到第
22、 2 周，中药干预组和模型组的异动症症状均略有加重。从第 2 周末到第 4 周，模型组的异动症症状进一步加重，而中药干预组症状有明显减轻。同时，中药干预组与模型组比较，D2 受体亲和力明显增高。从结果中进一步可以看到，异动症大鼠停用左旋多巴后，异动症症状均有下降趋势，但加用中药后，下降趋势更明显。受体活性结果也表明，中止给药+中药干预组与中止给药对照组比较，D2 受体亲和力上调更明显。说明中药可明显改善 LID 大鼠双侧尾壳核多巴胺 D2 受体活性，撤药可部分恢复多巴胺 D2受体活性，加用中药效果更佳。故认为滋补肝肾、通络解毒中药可以有效缓解异动症症状，明显改善 D2 受体功能。我们在临床研究
23、中证实，滋补肝肾、通络解毒中药具有增效减毒作用9 。过去在滋补肝肾、通络解毒中药治疗 PD 大鼠的研究中发现，中药可通过清除氧自由基10 ，增加大鼠酪氨酸羟化酶及其信使核糖核酸的表达11 ，抑制多巴胺神经元的凋亡12等机制来改善 PD 大鼠的旋转行为13 。而这些机制与 LID 密切相关，故可以认为滋补肝肾、通络解毒中药具有多靶点作用。【参考文献】1 Ba MW, Liu ZG, Kong M, et al. Establishment and evaluation of levodopainduced dyskinesias model in rats with Parkinsons dis
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