1、IL-1、IL-6 对人冠脉平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶-3 的影响作者：蒋知新，夏爱祥，张清华，方效民，李运田，杜大勇，赖晓辉【摘要】 目的 探讨炎症因子白介素-1(interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)对人冠脉平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)的影响。方法 采用 20 g/L 的 IL-1、10 g/L 的 IL-6 各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养 0、2、4、8、24、36 h 后收集细胞；采用不同质量浓度的 IL-1(0、5、20、40 g/L)、IL-6(0
2、、5、10、50 g/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养 6 h 后收集细胞。应用实时荧光定量 PCR 方法检测细胞内 MMP-3 基因的表达量。结果 在同剂量 IL-1、IL-6 刺激下，MMP-3 的表达量在 2 h 时就开始发生上调，8 h 达高峰，而后开始下降；在不同剂量 IL-1、IL-6 刺激下，MMP-3 的表达量在实验剂量范围内随着剂量的加大呈上升趋势(IL-1：r=0.907，P=0.000；IL-6：r=0.919，P=0.000)。各因子不同剂量组 MMP-3 的表达量均具有显著性差异(IL-1：F24.047，P=0.000；IL-6：F14.081，P=0.001)。
3、IL-1 20 g/L 和 40 g/L 组间 MMP-3 表达量没有显著性差异(P=0.154)，IL-6 5 g/L 和 10 g/L 组间 MMP-3 表达量没有显著性差异(P=0.292)。结论 炎症因子 IL-1、IL-6 能促进冠脉平滑肌细胞中斑块稳定相关标记物 MMP-3 的表达，这可能是炎症在急性冠脉综合征发生发展中的重要作用机制之一。 【关键词】 急性冠脉综合征；白介素-1；白介素-6；基质金属蛋白酶-3；炎症；荧光定量聚合酶链反应ABSTRACT: Objective To explore the effect of IL-1 and IL-6 on MMP-3 gene
4、expression in human coronary artery smooth muscle cells. Methods We used IL-1 (20 g/L) and IL-6 (10 g/L) to stimulate human coronary artery smooth muscle cells, which were co-culture for 0, 2, 4, 8, 24, 36 h. IL-1 (0, 5, 20, 40 g/L) and IL-6(0, 5, 10, 50 g/L) were used to stimulate human coronary ar
5、tery smooth muscle cells, which were co-cultured for 6 h. Then we detected the gene expression by fluorescent quantitation PCR. Results In the same concentration of IL-1 and IL-6, gene expression was up-regulated at 2 h, at 8 h the expression reached the peak, then began to descend. In different con
6、centration of IL-1 and IL-6, gene expression was up-regulated with the dose of IL-1 and IL-6 (IL-1: r=0.907, P=0.000; IL-6: r=0.919, P=0.000). There were significant differences in MMP-3 expression among different groups (IL-1: F24.047, P=0.000; IL-6: F14.081, P=0.001). There were no significant dif
7、ferences in matrix metalloproteinase-3 between IL-1 20 and 40 g/L groups (P=0.154) and between IL-6 5 g/L and 10 g/L (P=0.292). Conclusion It suggests that IL-1 and IL-6 can promote MMP-3 gene expression in human coronary artery smooth muscle cells, and it may be one of the mechanisms of inflammatio
8、n effect in acute coronary syndrome.KEY WORDS: acute coronary syndrome; interleukin-1; interleukin-6; matrix metalloproteinase-3; inflammation; fluorescent quantitation PCR大量研究表明炎症在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)的发生发展中起着非常重要的作用。ACS 的发生和不稳定斑块的破裂有关，不稳定斑块具有较薄的细胞外基质，而基质金属蛋白酶-3(matrix metalloprotei
9、nase-3, MMP-3)能降解细胞外基质，在斑块从稳定转向不稳定的过程中有着非常重要的作用。本研究应用炎症因子白介素-1(interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)刺激冠脉平滑肌细胞，观察其中 MMP-3 的表达变化，从而探讨炎症因素在 ACS中的作用机制。1 材料与方法1.1 细胞 人冠脉平滑肌细胞HCASMC(Casecade 公司)。1.2 试剂 231 培养基、培养基添加剂及胰酶(casecade 公司)；IL-1、IL-6(PeProtech 公司)；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(北京北化精细化学品有限责任公司)；Set of d
10、ATP、dCTP、dGTP、dTTP、RNasin Ribonuclease Inhibitor、Agarose(Promega, USA)；Oligo(dT)15-18 Primer(上海生工生物科技有限公司)；M-MLV Reverse Transcriptae、TRIZOL Reagent(Invitrogen, USA)；Taq DNA Polymerase、Loading Buffer (TaKaRa, Japan)；溴化乙锭(Sigma, USA)；SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒(Applied Biosystems, USA)。1.3 仪器 MCO-1
11、7AI CO2 恒温培养箱(SANYO, Japan)；CK2 型倒置显微镜(Olympus, Japan)；细胞超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)；Ultrospec 3100pro 型紫外分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech, UK)；DYC-31D 型电泳仪(北京六一仪器厂)；GEL-DOC2000 型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad, USA)；PTC200 PCR 扩增仪(MJ, USA)；MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate、MicroAmp 96-WellFull Plate Cover、ABI PRI
12、SM Optical Cover Compression Pads、7500 型实时荧光定量 PCR 仪及分析软件 SDS(Applied Biosystems, USA)。1.4 方法1.4.1 细胞培养及因子刺激 复苏的细胞在 37 、体积分数为 95%空气和 5% CO2 的培养箱中培养。实验用 5-7 代的细胞。将细胞按 2.5105/mL 接种于 25 cm2 的培养瓶中，24 h 后换液，培养 48 h 后细胞接近 80%融合时加入因子进行刺激。应用 20 g/L 的 IL-1、10 g/L 的 IL-6 各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养 0、2、4、8、24、36 h 后收集细
13、胞；应用不同质量浓度的 IL-1(0、5、20、40 g/L)、IL-6(0、5、10、50 g/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，6 h 后收集上清液和细胞。上清液-70 冻存，细胞用生理盐水冲洗两遍后用 TRIzol 消化。实验重复两次，分两期完成。1.4.2 细胞总 RNA 提取 采用细胞总 RNA TRIzol 试剂提取 RNA，严格按照试剂说明书进行操作。1.4.3 cDNA 的合成 取 5 L 总 RNA 进行逆转录反应，严格按照M-MLV 逆转录酶说明书进行操作。1.4.4 荧光定量 PCR MMP-3 引物应用软件自行设计，长度为 186 bp，F：5-TAT GGA CCT CCC
14、CCT GAC TCC-3，R：5- AGG TTC AAG CTT CCT GAG G -3 ；看家基因(GAPDH)为 108 bp，F：5- CAT CCA TGA CAA CTT TGG TAT C -3，R：5- CCA TCA CGC CAC AGT TTC -3(北京赛百胜科技有限公司制备合成)。反应条件：50 2 min，95 10 min，50 循环+95 15 s，60 1 h 5 min。1.5 统计学处理 所得数据应用 SPSS 11.0 软件包进行统计学描述与分析。计量资料用s 表示，多组间比较用 one-way ANOVA 检验，两两比较应用 SNK 法检验，并进行
15、 Spearman 相关分析。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 细胞总 RNA 质量及纯度检验 每份样品取 4 L 稀释至 400 L，测定其 A260 nm/A280 nm 吸光度比值均在 1.8-2.0 之间，说明所提 RNA 纯度较高；取稀释后的 RNA 1 L 与 Loading Buffer 混匀后，在 12 g/L 的琼脂糖凝胶中电泳图片上可见 RNA 清晰的 18 S 和 28 S 的条带，无弥散，说明 RNA 质量较好，无明显降解(图 1-4)。2.2 目的基因的表达情况 取细胞总 RNA 逆转录后，应用 2 L cDNA 进行实时荧光定量 PCR 实验，检
16、测细胞中 PAPP-A 基因的表达情况。扩增产物的溶解曲线图，峰值单一，说明引物特异性好，目的产物较纯。应用 7500 型实时荧光定量PCR 仪分析软件 SDS 进行处理分析，经过与管家基因(GAPDH)校正后，得出目的基因产物量比较的结果(图 5、图 6)。可见在同剂量 IL-1、IL-6刺激下，MMP-3 的表达量在 2 h 时就开始发生上调，8 h 左右达高峰，而后开始下降；在不同剂量 IL-1、IL-6 刺激下，MMP-3 的表达量在实验剂量范围内随着剂量的加大呈上升趋势(IL-1：r=0.907，P=0.000；IL-6：r=0.919，P=0.000)。各因子不同剂量组 MMP-3
17、 表达量均具有显著性差异(IL-1：F24.047，P=0.000；IL-6：F14.081，P=0.001)。IL-1 20 g/L 和 40 g/L 组间 MMP-3 表达量没有显著性差异(P=0.154)，IL-6 5 g/L 和 10 g/L 组间 MMP-3表达量没有显著性差异(P=0.292)。3 讨 论冠状动脉粥样硬化斑块的破裂、糜烂、出血并在此基础上促使冠脉痉挛和血栓形成，是 ACS 重要的发病机制。研究发现斑块的稳定与否主要取决于其性质而不在于其大小。与稳定斑块相比，不稳定斑块具有较大的偏心的不规则脂质核心，纤维帽较薄，并富含炎症细胞及炎症相关细胞，具有较高的不稳定性。纤维帽
18、的厚度、强度及胶原含量是决定斑块稳定性的主要因素，炎症细胞聚集及炎症反应是不稳定斑块的特征性表现。基质金属蛋白酶(MMP)是一组依赖于 Zn2+、Ca2+的蛋白酶家族,对细胞外基质成分有较高亲和力，几乎可降解所有 ECM 成分。近来研究发现 ACS 患者的血浆，甚至在尿液及唾液中 MMP 家族成员分泌水平升高，提示它可能参与 ACS 的病理进程1-5 。单岩等6研究认为 MMP-9 和MMP-2 可作为 ACS 患者早期诊断及预后疗效的判定指标。Zeng 等7研究发现血浆 MMP9 水平和高敏 C-反应蛋白水平显著相关，认为 MMP 系统可能是炎症在 ACS 中作用的组成部分。Tayebjee
19、 等8研究发现，高血压患者的 MMP-9 和金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)在基线水平升高，在进行了心血管危险因素的处理后，MMP-9 水平下降，而 TIMP-1 水平升高，并且 MMP 水平的升高和高 Framingham 心血管危险因子的积分显著相关。临床应用血脂康、阿托伐他汀、环氧化酶抑制剂等能够降低 ACS 患者血浆 MMP 的水平9-11 。目前普遍认为 MMP 能够降解动脉粥样硬化斑块中的细胞外胶原和基质，使纤维帽变薄，对机械外力的抵抗作用减弱,导致斑块趋向于不稳定化并最终破裂,引发 ACS。在众多
20、的 MMP 中，MMP-3 显得尤为重要，因为其底物广泛，可以单独降解构成细胞外基质的大部分成分，同时又可以激活MMP-1、MMP-8、MMP-9 的活性，共同参与细胞外基质的降解过程。MMP-3 与能够激活的其他酶原形成一正反馈环，在 MMP 家族激活过程中具有关键作用。刘丹等12研究发现 MMP-3 水平在 ACS 患者中显著升高。1999 年 Ross 提出动脉粥样硬化是炎症性疾病，炎症在不稳定斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的作用。尸检发现在不稳定或破裂的动脉粥样斑块内聚集着泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞，其中巨噬细胞数目不稳定斑块是稳定斑块的 4 倍；在斑块最易于破裂
21、的肩部，炎症细胞浓度最高，均提示炎症导致斑块不稳定，易破裂。研究发现不稳定斑块内的泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞等炎症细胞聚集13 ，分泌的致炎因子如 IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-、-抗干扰素、P-选择素、细胞黏附分子-等加速了动脉粥样硬化的过程，且 IL-1、IL-6 等炎症标志物在斑块内的表达也明显升高，甚至在全身血循环中的浓度也会升高。本研究应用不稳定斑块中最常见的炎症因子 IL-1、IL-6 刺激人冠状动脉平滑肌细胞，结果表明炎症因子能够在基因转录水平上调人冠状动脉平滑肌细胞中 MMP-3 的表达，并且呈剂量依赖效应。提示不稳定斑块中炎症因子和炎症反应的存在可能
22、是MMP 表达上调的原因。正常的纤维帽主要由血管平滑肌细胞分泌的胶原和基质构成，在不稳定斑块中存在的炎症因素刺激斑块和血管结合部位的血管平滑肌细胞表达 MMP-3，自身及被其激活的 MMP 降解细胞外胶原和基质，使斑块纤维帽变薄，导致斑块不稳定性增加，进而破裂引起 ACS 发病,可能是其作用机制之一。总之，本研究体外模拟不稳定斑块的局部炎症条件，探讨了 IL-1、IL-6 对人冠脉平滑肌细胞表达 MMP-3 的影响，结果表明炎症因素能够引起 MMP-3 的上调可能是其作用的途径之一。这为针对炎症作用途径上的治疗和预防提供新的视角和依据。【参考文献】1丁士芳，张运，张梅，等. 斑块稳定性与炎症反
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