1、5AzaCdR 对人肾癌 OSRC2 细胞生长及 连环蛋白表达的影响作者：陶美满， 孙浩， 田福起， 马克钧， 郭涛， 潘鹏， 徐强【摘要】 目的： 研究甲基化抑制剂 5 氮杂2 脱氧胞苷（5AzaCdR ）对人肾癌 OSRC2 细胞增殖、凋亡及 连环蛋白（catenin ）表达的影响。方法： 使用不同浓度（10-7，10-6，10-5,10-4 mol/L）的特异性 DNA 甲基转移酶抑制剂 5AzaCdR 处理OSRC2 肾癌细胞株。MTT 检测 5AzaCdR 对肾癌细胞株 OSRC2的生长抑制作用。流式细胞仪检测 5AzaCdR 对 OSRC2 肾癌细胞株凋亡的影响。细胞免疫化学检测
2、5AzaCdR 处理 OSRC2 肾癌细胞株后 catenin 表达的变化。结果： 5AzaCdR 明显抑制肾癌细胞的增殖，促进其凋亡，且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后 连环蛋白表达增加。结论： catenin 蛋白表达受甲基化的抑制，提示 5AzaCdR 可使 catenin 基因去甲基化而抑制肾癌OSRC2 细胞株增殖，并促进其凋亡。 【关键词】 5 氮杂2 脱氧胞苷； 肾癌； 连环蛋白； 细胞凋亡; 甲基化Abstract Objective: To investigate the effect of methylation inhibitor 5Aza2deoxycytidine
3、 on the growth of human renal cancer cell line OSRC2 and catenin expression.Methods： Human renal carcinoma OSRC2 cells were treated with different concentrations of 5AzaCdR （10-7,10-6,10-5,10-4 mol/L） respectively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The apoptosis was analyzed
4、 by flow cytometry.The immuneocytochemistry was used to detect catenin levels in the cell line before and after treatment with 5AzaCdR. Results： 5AzaCdR can inhibit the growth of OSRC2 cells，and the apoptotic rate was also increased after 5AzaCdR treatment.catenin expression levels in OSRC2 cells we
5、re increased after 5AzaCdR treatment. Conclusion： catenin expression levels were inhibited by methylation, 5AzaCdR can inhibit the growth,and promote the apoptosis of OSRC2 cells by inducing demethylation in the promoter region of catenin gene.Key words 5Aza2deoxycytidine; renal carcinoma; catenin;
6、cell apoptosis;methylation肾细胞癌的发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，目前的治疗仍以根治性手术为主，但术后复发率达 20%以上，且放、化疗效果不佳，因此迫切需要早期诊断方法和其他有效的治疗1 。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关, 抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明, 抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等2 。 连环蛋白(catenin) 是一种多功能蛋白质，近年研究显示catenin 蛋白在多种肿瘤中表达减少, 国外有研究证实在肾癌组织及细胞其表达明显下调3,启动子区域 CpG 岛的过甲基化可能是其失活的主要方式,国内尚无相关的研究。我们采
7、用 5 氮杂2 脱氧胞苷(5AzaCdR) 对肾癌细胞株进行处理,检测 catenin 表达,进一步研究肾癌细胞中 catenin 表达下降是否与基因甲基化有关，探索上调或恢复肾癌细胞中 catenin 正常表达的可能机制。1 材料与方法1.1 材 料人肾癌细胞株 OSRC2 购于上海细胞生物所；胎牛血清（杭州四季青） ；DMEM 培养基、胰酶、DAB 显色试剂盒及 SABC 试剂盒（武汉博士德） ；5AzaCdR （Sigma 公司） ，用 PBS 充分溶解后保存于70 冰箱备用；兔抗人 连环蛋白多克隆抗体、MTT 及二甲亚砜（Sigma 公司） ；凋亡检测试剂盒(美国 BD 公司)。1.2
8、 方 法1.2.1 细胞培养 人肾癌细胞株 OSRC2 用含 10胎牛血清的DMEM 培养液培养（37，5CO2，饱和湿度） ，隔日换液，细胞长满培养瓶壁的 8090后，按照 13 传代，取对数生长期的细胞进行试验。1.2.2 MTT 法检测细胞增殖活性 对数生长期细胞以每孔 5 000个细胞密度接种于 5 块 96 孔板中,过夜贴壁后,加入不同浓度的5AzaCdR, 每孔 180 l,每组设 5 个复孔,并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每 24 h 更换 1 次,每天取出 1 板,加入 5 g/L 的 MTT 溶液 20 l,37，5CO2 培养箱中继续培养 4 h 后弃
9、去上清,每孔加入 150 l DMSO,振荡 10 min 充分溶解结晶,置酶联免疫检测仪上测定波长 490 nm 下的光密度值，细胞生存率以平均光密度（D）值分析，以 D 值为纵坐标，以时间（h）为横坐标，绘制生长曲线图。1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 按照试剂盒的说明操作，收集药物处理后的细胞，用 PBS 洗涤 2 次,缓冲液调整细胞浓度为 106/ml，取100 l 加入 5 ml 流式管，然后加入 5 l AnnexinVFITC 混匀后，加入 5 l PI 混匀。避光、室温孵育 15 min，加入 400 l 缓冲液，以流式细胞仪进行检测，以未用药物处理的细胞作对照。1.2.4
10、细胞免疫化学法检测 catenin 表达 采用细胞爬片法，按试剂盒说明采用 ABC 三步法。参照文献4方法进行半定量评分（分A，B 两项）：A 项，按切片中细胞显色深浅计分,0 分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2 分：显黄色，3 分：显棕黄色；B 项，按显色细胞的比例评分,1 分：130，2 分：3175，3 分：76100。两项指标结合积分：阴性（ ）积分为 0 分；阳性（+）积分为 14 分；强阳性（+）积分为 56 分。每组计数 5 个视野，每个视野计数 200 个细胞。1.2.5 统计学处理 采用 SPSS11.5 软件包进行统计学分析，多组比较采用 F 分析，两两比较采用 LSDt
11、检验，非正态数据组间两两比较采用 Nemenyi 法检验，P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 不同浓度 5AzaCdR 处理后 OSRC2 细胞的增殖活性MTT 检测发现 5AzaCdR 能抑制人肾癌细胞株 OSRC2 增殖(图 1)，且与时间和药物浓度有关。2.2 不同浓度 5AzaCdR 处理后 OSRC2 细胞的凋亡结果不同浓度(10-7，10-6，10-5 mol/L)的 5AzaCdR 处理OSRC2 细胞后，其各组细胞凋亡率分别为（3.740.34）%， （7.850.59）%， （12.931.32）%，对照组为（0.860.08）%，采用 F 检验，F=189.7
12、，P0.01，进一步采用 LSDt 检验，10-7，10-6，10-5 mol/L，0 mol/L 之间两两比较，P 均0.05，差异有统计学意义。 （10-4 mol/L 的 5AzaCdR 处理 72 h 后细胞大多死亡，无法检测。）2.3 细胞免疫组化结果采用 KruskalWallis H 检验，H=228.92,P0.01；进一步采用 Nemenyi 法两两比较，10-7 mol/L 和 10-6 mol/L 5AzaCdR 两组间2 =252.16，10-7 mol/L 和 10-5mol/L 5AzaCdR 两组间 2 =396.48，10-6 mol/L 和 10-5 mol/
13、L 5AzaCdR 两组间 2 =12.87，P 均0.01。表明经甲基化抑制剂处理后 catenin 表达增加，各组间差异均有统计学意义（图 2，表 1） 。 表 1 不同浓度免疫组化积分结果（细胞数 n200）3 讨 论catenin 是一种多功能蛋白质，相对分子质量约为 83 kD，基因定位于 17q21 上，参与由 Ecadherin 介导的细胞间黏附与信号传导两大功能，研究显示 catenin 在非小细胞癌5 、乳腺癌6等多种肿瘤中表达减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，但其在肿瘤中表达下降的机制尚不清楚。DNA 甲基化在肿瘤相关基因表达中具有重要作用，它可以通过基因启动子及其附近区域
14、内 CpG 岛胞嘧啶的甲基化关闭某种组织或细胞不必要的基因，使之不表达或沉默。研究表明，抑癌基因的失活和表达降低与其启动子区域的高甲基化状态有关7，8 ，而 DNA 甲基转移酶的表达水平升高和活性增加被认为是引起抑癌基因启动子区域发生高甲基化的主要原因之一9 。 5AzaCdR 是 DNA 甲基转移酶1(DNMT1)的抑制剂，体外实验证明其可抑制多种肿瘤细胞的生长。肾癌中 catenin 表达减少可能与其基因甲基化有关3 ，国内尚无相关报道。本实验用 5AzaCdR 处理人肾癌 OSRC2 细胞后，从 MTT 法检测的细胞生长曲线可以看出细胞增殖受到不同程度的抑制，流式细胞仪检测发现 5Aza
15、CdR 能促进 OSRC2 的凋亡，这提示5AzaCdR 抑制肾癌细胞生长是通过诱导其早期凋亡来实现的。免疫组化显示 OSRC2 细胞经 5AzaCdR 处理后 catenin 蛋白表达增加，且与 5AzaCdR 浓度有关，细胞生长缓慢，恶性程度下降，说明catenin 蛋白具有抑制肾癌细胞生长的作用。同时 catenin 蛋白表达受甲基化的抑制，5AzaCdR 可使 catenin 基因去甲基化上调catenin 蛋白表达，这说明肾细胞癌中 catenin 基因可能存在过度甲基化，而其过甲基化就是引起 catenin 蛋白在肾癌细胞株中表达下降甚至缺失的主要机制，这需要我们更深入的研究。目前
16、，5AzaCdR 在国外已有用于治疗白血病的尝试10 。综上所述，catenin 蛋白在肾癌细胞株中表达明显下降，5AzaCdR 能上调其表达，诱导肿瘤细胞凋亡。进一步对 catenin基因甲基化的研究为探讨肾细胞癌的发病机制和早期诊断、治疗提供了一种新思路。【参考文献】1 张 骞，金 杰，陶 谦，等.抑癌基因甲基化在肾细胞癌研究中的新进展J.癌症，2007，26（11）：1276-1280.2 Tamura G.Alterration of tumor suppressor and tumorrelated genes in the development and progression o
17、f gastric cancerJ.World J Gastroenterol,2006,12(2):192-198.3 Breault J E,Shiina H,Igawa M，et al.Methylation of the catenin gene is association with poor prognosis of renal cell carcinomaJ.Clin Cancer Res,2005,11(2Pt1):557-564.4 Bames DM，Dublin EA，Fisher CJ，et al.Immunohistochemical detection of P53
18、protein in mammary carcinoma:an important new independent indicator prognosisJ.Hum Pathol,1993,24(5):469-476.5 王丽华,蒋军广.catenin 在非小细胞肺癌组织中的表达及临床生物学意义J.中国老年学杂志，2007,27（3）:266-267.6 Sarrio D,Moreno G,Hardisson D,et al.Epigenetic and genetic alterations of APC and CDH1 genes in lobular breast cancer:rel
19、ationships with abnormal Ecadherin and catenin expression and microsatellite instabilityJ.Int J Cancer,2003,106(2):208-215.7 Szyf M.Methylation and demethylation as targets for anticancer therapyJ.Biochemistry(MOSC),2005,70(5):533-549.8 Ito M,Ito G,Kondo M,et al.Frequent inactivation of RASSF1A,BLU,
20、and SEMA3B on 3p21.3 by promoter hypermethylation and allele loss in nonsmall cell lung cancerJ.Cancer Lett，2005,225(1):131-139.9 Hermann A,Gowher H,Jeltsch A.Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases J.Cell Mol Life Sci,2004,61(19/20):2571-2587.10 Wijermans P,Lubbert M,Verhoef G,et al.Lowdose 5aza2deoxycytidine,a DNA hypomethylating agent for the treatment of highrisk myelodysplastic syndrome:a multicenterphasestudy in elderly patientsJ.J Clin Oncol,2000,18(5):956-962.
