1、HCV 核心蛋白与 HCBP1 在哺乳双杂交系统中的相互作用作者：陈云茹 刘敏 陈天艳 张树林 陈瑞琳 张曦 石磊 【摘要】 目的：探讨 HCVcore 与 HCBP1的相互作用. 方法：PCR 分别扩增含 HCV core及 HCBP1的 cDNA片段，克隆入 pGEM T载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒 pM 和 pVP16中，并转染入COS7 细胞，48 h后检测细胞中报告基因 CAT的表达水平. 结果：CATELISA 检测显示 pMcore 与 pVP16HCBP1 实验孔 A405 nm值为0.1288，高于其它阴性对照，但低于阳性对照组 A值. 结论：哺乳双杂交
2、系统证实 HCV核心蛋白与新基因 HCBP1有一定的相互作用，可进一步研究 HCBP1的细胞功能. 【关键词】 HCV 核心蛋白；哺乳双杂交；报告基因 基金项目：国家自然科学基金（30471532） ；陕西省科学技术研究发展计划项目（2004K15G1 ） 【Abstract】 AIM: To analyze the interaction between HCV core protein and HCBP1 using mammalian twohybrid assay. METHODS: cDNA fragments encoding HCV core protein and HCBP1
3、were amplified by PCR and subsequently cloned into pGEM T vector, respectively. After verified by sequencing, they were respectively subcloned into two hybrid plasmids, pM and pVP16. Then, pMcore, pVP16HCBP1 and pG5CAT, a reporter vector, all were cotransfected into COS7 cells. Fortyeight hours late
4、r, the interaction between HCV core protein and HCBP1 was assayed by detecting CAT gene expression. RESULTS: CATELISA showed that the A value of the cotransfection experiment group was 0.1288, significantly higher than those of the other negative control groups and lower than that of the positive co
5、ntrol group. CONCLUSION: Mammalian twohybrid assay confirms HCBP1 can bind with HCV core protein to some extent. Based on this, we can study the function of HCBP1 further. 【Keywords】 hepatitis C virus core protein；mammalian twohybrid assay； reporter gene 0 引言 丙型肝炎病毒（HCV）核心区位于 HCV基因组的 342914nt，其编码的核心
6、蛋白 (core protein) 由 191个氨基酸组成，是最保守的 HCV蛋白. 核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用1. 临床和实验研究显示核心蛋白具有广泛的反式激活作用，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因2-3. 我们以往应用酵母双杂交系统4 ，以 HCV核心蛋白为诱饵蛋白，在肝文库中筛选到 HCV核心蛋白的相互作用蛋白，并命名为 HCBP1(GenBank: AF359506)，其主要功能目前尚不清楚.为了研究 HCBP1的作用，我们应用哺乳动物双杂交系统以证实 HCV核心蛋白与
7、HCBP1的相互作用，为研究 HCBP1的功能奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 Mammalian MATCHMAKER TwoHybrid Assay Kit（美国Clontech公司） ；CAT ELISA Kit（瑞士 Roche公司） ；克隆有 HCV 核心蛋白 cDNA的质粒 pGBKT7HCV core本室保存; 肝 cDNA文库本室保存；PCR Taq酶（美国 Promega公司） ，DNA 重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（大连宝生物公司） ；DNA 凝胶回收试剂盒Lipofectamine2000（Invitrogen 公司） ，测序由上海生工生物工程有
8、限公司完成. COS7 细胞（中国科学院细胞库） ; PureYield TMPlasmid Midiprep System（美国 Promega公司）. 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增 克隆编码核心蛋白基因的上游引物P1：5GAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCTC3 ； 下游引物P2：5GAATTCGGCTGAAGCGGGCACAGTC3 ；以质粒 pGBKT7HCV core为模板，PCR 反应条件为：94 30 s，50 30 s，72 60 s，共 35个循环. 克隆编码 HCBP1蛋白基因的上游引物P1：5GAATTCATGTGCTCACTGCCTGTGCCCC
9、G3 ；下游引物P2：5GGATCCGGAAGCTGGGCTCGGGGCAG3 ；以肝 cDNA文库为模板，PCR反应条件为：94 60 s，63 60 s，72 60 s，共 30个循环. 1.2.2 PCR产物的克隆及鉴定 回收的 PCR产物与 pGEM T 载体相连，转化大肠杆菌 DH5，进行蓝白筛选. 用 EcoR和 BamH双酶切鉴定及 PCR鉴定后将含插入片段的阳性克隆分别命名为 pGEM Tcore 及pGEM THCBP1 ，进行序列分析. 1.2.3 表达载体的构建及鉴定 用 EcoR和 BamH酶切 pGEM Tcore 和表达载体 pM，pGEM THCBP1 和 pVP
10、16，回收 core protein，pM，HCBP1 及 pVP16，载体与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5，经限制性内切酶和 PCR分析，含正确插入片段的克隆分别命名为pMcore 和 pVP16HCBP1 ，并用质粒提取试剂盒进行大规模的质粒提取和纯化. 1.2.4 转染 COS7 细胞 于转染前 1日将细胞用胰酶消化，计数并铺板，使转染当日细胞融合度为 90%95%. 在铺板和转染期间避免使用抗生素. 对每个转染样本进行如下操作： 在 500 L 无血清的培养基中稀释以下三种质粒共 8.8 g，使 pMcore 质粒pVP16HCBP1CAT 质粒比例为 551; 在每孔中，用 500
11、 L 无血清培养基稀释 22 L 阳离子脂质体试剂，室温孵育 510 min; 将稀释的 DNA同稀释的脂质体试剂混合，室温保温 20 min; 用 1 mL无血清培养基在转染前清洗细胞; 将质粒 DNA与脂质体试剂的混合物加入细胞，37 50 mL/L CO2保温 6 h; 6 h后弃去复合物，加入新鲜的完全培养基至正常体积; 转染 48 h后，弃去细胞培养液，用 5 mL冰预冷的 PBS洗细胞 3遍，最后小心弃去 PBS; 加 1 mL lysis buffer，室温 30 min; 将细胞溶解后置于 1.5EP中，4，离心 10 min; 吸取上清于-70迅速冷冻待检. 实验同时设立阴性
12、和阳性对照组. 1.2.5 报告基因表达的检测 按 CAT ELISA Kit说明操作. 标准孔：每孔加入 0，1.0， 0.5， 0.25，0.125 mg/L CAT酶标准稀释液200 L, 实验孔：每孔加入细胞提取液 200 L，37，1 h; 弃去液体，漂洗液 250 L30 s5次，弃去漂洗液; 每孔加入抗CATDIG 液 200 L，37，1 h; 弃去液体，漂洗液 250 L30 s5次，弃去漂洗液; 每孔加入抗 CATDIGPOD 液 200 L，37 1 h; 弃去液体，漂洗液 250 L30 s5次，弃去漂洗液; 每孔加入 POD底物 200 L; 在酶标仪上测定各孔 A4
13、05 nm值，以空白孔调零. 统计学处理：所有数据采用 SPSS 11.0软件进行统计分析. 计量资料以 xs表示，采用 LSDt 检验. P0.05 为差异具有统计学意义. 2 结果 2.1 核心蛋白及 HCBP1基因片段编码区的扩增 扩增出与预期大小一致的 cDNA片段（图 1，2）. 核心蛋白大小为 573 bp，HCBP1 大小为959 bp. 1：HCV core cDNA; 2：阴性对照; M：DNA marker. 图 1 HCV core基因片段编码区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略） 1：HCBP1 cDNA; M：DNA marker. 图 2 HCBP1基因片段编码区扩增产物
14、的琼脂糖凝胶电泳（略） 2.2 重组 pGEM Tcore 质粒及 pGEM THCBP1 质粒的序列分析 将鉴定正确的 pGEM Tcore 质粒及 pGEM THCBP1 质粒分别作正反方向的测序，表明所扩增的核心蛋白和 HCBP1基因序列与 Genbank中的 HCV 核心蛋白和 HCBP1序列完全一致（图 3，4）. 图 3 HCV core PCR产物的测序结果与 HCV core基因序列的比对（略） 2.3 重组 pMcore 及 pVP16HCBP1 质粒的酶切分析 用 EcoR和 BamH对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切下的片段与扩增片段大小一致（图 5，6）. 图 4 HCBP
15、1 PCR产物的测序结果与 HCBP1基因序列的比对（略） 13： HCV core cDNA 片段; M：DNA marker. 图 5 重组 pMcore 质粒的 EcoR和 BamH双酶切鉴定（略） 12： HCBP1 cDNA 片段; M：DNA marker. 图 6 重组 pVP16HCBP1 质粒的 EcoR和 BamH双酶切鉴定（略） 2.4 CAT报告基因的检测处理 pMcore 及 pVP16HCBP1 共转染孔呈淡蓝色，阴性对照孔无成色反应，阳性对照孔呈现蓝色反应. 各孔吸光度 A值见表 1. CATELISA 检测结果显示 pMcore 与 pVP16HCBP1实验孔
16、A405 nm值为 0.1288，高于其它阴性对照组，表明在哺乳细胞中HCV 核心蛋白与 HCBP1可发生一定的相互作用. 表 1 质粒共转染各组 A值（略） aP0.05 vs 未转染、背景对照、阴性对照. 3 讨论 大量研究表明，HCV 核心蛋白是一个具有多种生物学功能的病毒蛋白，除了作为核壳蛋白参与组装病毒颗粒外，还可以调控细胞、病毒的基因表达及细胞周期和免疫功能. 国内外学者通过病例 对照研究，体外细胞培养及转基因鼠模型的研究发现，HCV 核心蛋白能够抑制细胞凋亡的启动5-6 ，但也有研究表明，在不同的细胞系中，HCV 核心蛋白能增强被感染细胞凋亡的敏感性. 核心蛋白作为一种反式激活蛋
17、白，不仅可以激活人类 cmyc 基因，IL2 和 SV40早期启动子活性，也能够抑制 T细胞增殖和 IFN 的产生，阻碍机体对 HCV感染肝细胞的清除，促使 HCV感染慢性化及 HCC的发生7. HCBP1 基因是我们通过酵母双杂交系统筛选出的与 HCV核心蛋白相互作用的新蛋白，其全长 959 bp，编码 319个氨基酸，Mr 约为 35 ku，其中非极性疏水性氨基酸 114个，极性中性氨基酸 83个，通过生物信息学工具 BLAST进行检索，发现 HCBP1与氨基酰化酶（ACY3）的基因序列具有高度同源性. 目前的研究显示，ACY3 在乙酰化氨基酸的去乙酰基过程中具有重要作用8 ，而乙酰化是一
18、种重要的基因表达调控方式，组氨酸的乙酰化和去乙酰化紊乱可能引起转录抑制，基因表达异常，从而诱发肿瘤的发生. 研究还发现去乙酰化酶抑制剂可通过改变 p21, p53等基因的乙酰化程度来改变基因的表达9 ，进而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡. p53基因可以通过促进 p21基因的表达抑制肿瘤细胞的生长，它的活性与它的乙酰化状态有密切的关系. 由此我们推测，与ACY3有很高同源性的 HCBP1，可能也参与了乙酰化氨基酸的去乙酰基过程. 本次的哺乳细胞双杂交实验再次证实了 HCV core蛋白与 HCBP1两者的相互作用. 通过研究 HCBP1的细胞功能，可能为进一步阐明 HCV核心蛋白在细胞凋亡
19、及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路. 【参考文献】 1 Ratna BR, Ranjit R. Hepatitis C virus protein: intriguing properties and functional relevance J.FEMS Microbiol Lett，2001,(202):149-156. 2 Min L, ShuLin Z, Jun C, et al. Genes transactivated by hepatitis C virus core protein, a microarray assayJ. World J Gastroenterol, 20
20、05, (22):3351-3356. 3 Min L, Yan L, Jun C, et al. Transactivating effect of hepatitis C virus core protein: A suppression subtractive hybridization studyJ. World J Gastroenterol, 2004,(12):1746-1749. 4 刘 敏，张 伟，陈天艳，等.HCV 核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测.第四军医大学学报, 2006,27（3）：241-244. 5 Ray RB, Lagging LM, Mey
21、er K, et al. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis C virus core proteinJ. Virus Res, 1995,37(3): 209-220. 6 RubbiaBrandt L, Taylor S, Gindre P, et al. Lack of in vivo blockade of Fas and TNFR1mediated hepatocyte apoptosis by the hepatitis C virusJ. J Pathol, 200
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