1、STZ 诱导的糖尿病鼠视网膜 -连环蛋白表达上调作者：李养军 惠延年 王雨生 【摘要】 目的: 探讨链脲霉素（Streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病鼠视网膜 -连环蛋白（-catenin）表达以及与早期糖尿病视网膜病变发展的可能关系。方法: 建立 STZ诱导的糖尿病大鼠模型，用伊文思蓝检测视网膜血管的渗透性；免疫组织化学和 Western blot方法检测糖尿病鼠视网膜及胰蛋白酶消化的视网膜微血管 -连环蛋白的表达情况。结果：糖尿病诱导 4、8 和 12wk后视网膜血管渗透性分别增加68%、91%和 125%（P 0.005） 。免疫组化分析证实对照组视网膜 -连环蛋白主要表达在视
2、网膜光感受器、外网状层、内网状层、神经节细胞层、内界膜及视网膜微血管内皮细胞和周细胞。STZ 诱导糖尿病大鼠12wk后，视网膜及视网膜微血管 -连环蛋白表达显著增加。Western blot分析证明随着糖尿病视网膜病变的发展，视网膜 -连环蛋白表达显著增加。 结论：STZ 诱导的糖尿病视网膜 -连环蛋白的表达增加，提示 -连环蛋白可能参与早期糖尿病视网膜病变的发生。 【关键词】 -连环蛋白 糖尿病 视网膜病变 StreptozotocinIncreased expression of -catenin in the streptozotocin-induced diabetic rat ret
3、inaAbstract AIM: To study the expression of -catenin in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rat retina and the possible relevance of -catenin in the early stage of STZ-induced diabetic retinopathy. METHODS: Vascular permeability was quantified by measuring albumin leakage from blood vessels into t
4、he retina using the Evans blue method. The model of STZ-induced diabetic rat was set up. -catenin expression was measured in both normal and STZ-induced diabetic rat retinas and retinal microvessel using immunohistochemistry and Western blot analysis. RESULTS: Retinal vascular permeability was incre
5、ased by 68%, 91% and 125% in the 4-, 8- and 12-week diabetic retinas, respectively, compared with that in the controls (P 0.005). Immunohistochemistry showed the expression of -catenin was detected and localized to the photoceptor, outer plexiform layer, inner plexiform layer, ganglion cell layer，in
6、ternal limiting membrane and microvessel of rat retinas. However, the expression of -catenin was significantly increased in STZ-induced diabetic rat retinas with the progression of diabetes. CONCLUSION: The increased expression of -catenin in the retinas of STZ-induced diabetic rat may reflect that
7、-catenin participates in the development of diabetic retinopathy. KEYWORDS: -catenin; diabetes; retinopathy; streptozotocin0 引言糖尿病视网膜病变是引起糖尿病视力损害严重的并发症，也是重要的致盲眼病。其早期损害的标志是视网膜微血管周细胞凋亡、血视网膜屏障的破坏、血管渗透性增加和进展性的血管闭塞。目前详细的发病机制仍然不清楚。近来的研究发现，N-钙粘蛋白簇生在不同组织微血管内皮细胞和周细胞之间的黏附连接及视网膜组织，对内皮细胞和周细胞之间相互作用起关键的作用，且对血管的成熟
8、和稳定起决定性作用1-3。-连环蛋白（-catenin）调控钙粘蛋白介导的黏附连结，钙粘蛋白的细胞质域羧基端结合到 -连环蛋白，依次与 -连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架相联系。这些相互作用对正常的黏附系统的活性至关重要，因为-连环蛋白对钙粘蛋白结构构成和功能方面起重要的作用。但是目前为止没有关于 -连环蛋白在糖尿病视网膜病变中的作用的相关证据。探讨-连环蛋白在 STZ诱导的鼠糖尿病视网膜中的表达及其对糖尿病视网膜病变的可能性作用可能有助于深入了解糖尿病视网膜病变的发病机制。1材料和方法1.1材料 糖尿病大鼠模型的建立，雄性 S-D大鼠（第四军医大学实验动物中心） ，饥饿 8h后称重量约重量约 25
9、015g，随机分配到对照组（n =30） ，糖尿病组（n = 30） 。大鼠分笼饲养，每笼 4只，无限制的标准鼠食和水,饲养场所通风良好，室温 1825oC，相对湿度40%70%，12h 光照昼夜循环。大鼠禁食 12h后，轻度麻醉(氯胺酮 40mg/kg),按 70mg/kg剂量 1次 ip溶解在 0.05mmol/L，pH4.5，灭菌枸橼酸盐缓冲液，含量为 20g/L的 STZ(Sigma公司)，使用前临时配置。注射7d后经大鼠尾静脉穿刺取全血检查空腹血糖，血糖15mmol/L 以上者为糖尿病大鼠模型建立成功。正常大鼠接受 1次 ip 0.05mmol/L等体积枸橼酸盐缓冲液作为对照组。以后
10、每周监测血糖和重量。1.2方法1.2.1视网膜组织切片和视网膜消化的准备 过量 ip戊巴比妥钠处死大鼠，摘除眼球。40g/L 多聚甲醛固定 24h，0.01mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗 24h，去除眼前节组织，分离视网膜。用于视网膜免疫组织化学的视网膜，常规行石蜡包埋，5m 厚的组织切片置于多聚赖氨酸处理的载玻片。用于微血管消化的视网膜，将磷酸盐缓冲液冲洗后的视网膜置于含有 30g/L的胰蛋白酶的 0.1mol/L Tris-HCL缓冲液，pH7.8，在 37水浴中摇动，孵化 2h后，再将其转到 0.01mol/L磷酸盐缓冲液，吸出液体后再加入 30g/L的胰蛋白酶的 0.1mol/L Tri
11、s-HCL缓冲液消化直到血管清晰，用蒸馏水冲洗，洗去剩余的神经组织，将其置于多聚赖氨酸处理的载玻片上，室温空气中干燥，储存在-20备用。1.2.2视网膜血管渗透性测量 用伊文思蓝的方法测量血管渗透到视网膜血清白蛋白4-5。大鼠麻醉后，沿尾静脉注射 30mg/kg伊文思蓝(Sigma公司)观察鼠全身变蓝，2h 后打开胸腔，沿左心室注射10g/L，370C 多聚甲醛柠檬酸液，压力为 120mmHg，清除血管内的伊文思蓝，2min 后摘除眼球，分离视网膜。将视网膜放入 150L 甲酰胺，70孵育 18h后提取伊文思蓝，7 000g，离心 20min，取 100L 上清测量在620nm的吸收率。据伊文
12、思蓝标准曲线，用伊文思蓝（g）/总蛋白浓度含量（g）来计算伊文思蓝的含量。1.2.3免疫组化分析视网膜 -连环蛋白表达 石蜡包埋的视网膜组织切片常规二甲苯脱蜡，酒精逐级脱水，脱水后的视网膜组织切片 PBS冲洗后用枸橼酸缓冲液微波法行抗原修复，抗原修复后的石蜡切片和视网膜微血管铺片用 0.01mol/L冲洗，30g/L 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性后 PBS冲洗。正常羊血清(Vector Laboratories Inc. USA)封闭30min，倾去多余，滴加 1200 兔抗 -连环蛋白一抗(Santa Cruz)，4过夜，PBS 冲洗，滴加 11 000生物素化的羊抗兔二抗(Vector
13、 Laboratories Inc. USA)30min，PBS 冲洗，滴加辣根过氧化酶结合的卵白素 30min，PBS 冲洗后，DAB(Sigma, St. Louis, MO, USA)显色。阴性对照组未加一抗。酒精脱水，二甲苯透明后封片。1.2.4 Western blot分析视网膜 -连环蛋白水平 分别在 4、8和 12wk麻醉后处死大鼠，摘除眼球，分离视网膜，在冰上切碎，液氮冷冻，-800C 保存。Western blot前，将视网膜组织用 10倍体积的组织细胞裂解液（含 20mmol/L Tris-HCl, pH 7.4; 150mmol/L NaCl; 1mmol/L EDTA;
14、 10ml/L Triton X-100; 5g/L sodium deoxycholate; 1g/L SDS; 0.2g/L sodium azide; 1mmol/L PMSF和 0.005g/L leupeptin）匀浆，16 000g离心 20min，取上清，Bradford 法测定蛋白浓度(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。等量的蛋白各 25g，用 2倍浓度的等体积蛋白上样缓冲液，100加热 5min，冷却到室温，把蛋白样品直接上样到8%SDS-PAGE胶加样孔内。在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。溴酚蓝到达胶的底端处附近
15、停止电泳，用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-甲醇缓冲液将蛋白电转移到硝基纤维膜上 1.5h后，用丽春红染色液染色。转膜完成后，在 Western洗涤液中漂洗 2min，吸尽洗涤液后，加入含 50g/L的乳脂粉 0.5g/L Tween-20 的 PBS封闭液在摇床上室温封闭 1h。吸尽封闭液，加入 11 000的兔抗-连环蛋白一抗(Santa Cruz)，4孵化过夜，膜用 Western洗涤液在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 510min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 510min。共洗涤 3次。滴加 1:1 000辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG二抗(Vector Laboratories Inc.
16、USA)，室温 2h。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 510min。共洗涤 3次。用增强的化学发光试剂盒(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)分析，将所得的阳性条带进行光密度测定，光密度面积计算 -连环蛋白含量。统计学处理： 所有实验数据用 表示，用 Premier 5.0统计分析软件，两组均数比较用 t检验，P 0.05 认为有显著差别。2 结果2.1大鼠体质量和血糖水平的变化 STZ诱导的糖尿病大鼠体重显著减轻与对照组相比(P 0.05)，12wk 后糖尿病鼠体 23614.1g(n =30)。对照组数体质量为 49610.2g(n =30).（图
17、1A） 。STZ 诱导的糖尿病大鼠血糖水平显著升高与对照组相比(P 0.05)，糖尿病诱导 12wk后血糖为30.24.8mmol/L (n =30)，对照组血糖为 4.9 0.12mmol/L n =30)（图 1B） 。图 1 STZ诱导的糖尿病大鼠体质量和血糖的变化2.2 STZ诱导的鼠视网膜微血管渗透性 视网膜血管渗透性测量用伊文思蓝方法。与对照组相比，糖尿病诱导 4、8 和 12wk后视网膜血管渗透性分别增加 68%、91%和 125%。图 2 糖尿病诱导的视网膜血管渗透性变化 图中 N、D4、D8 和 D12分别代表对照组、糖尿病诱导后 4、8 和 12wk视网膜血管渗透性。* P
18、 0.005与对照组, *P 0.005与对照组和糖尿病 4wk, *P 0.005 与对照组和糖尿病 4wk和 8wk。2.3 STZ诱导的鼠视网膜 -连环蛋白表达 免疫组化分析结果表明，STZ 诱导的糖尿病大鼠 12wk后，视网膜 -连环蛋白的表达较对照组显著增加，-连环蛋白的免疫反应性主要分布在光感受器、外网状层、内网状层和神经节细胞层及内界膜（图 3） 。阴性对照组无表达。图 3 视网膜 -连环蛋白表达 SABC200 A：对照组；B：糖尿病鼠 12wk2.4 STZ诱导的鼠视网膜微血管 N-钙粘蛋白表达 视网膜血管消化铺片免疫组织化学染色发现对照组视网膜血管表达 -连环蛋白，免疫组化
19、染色分布在周细胞和内皮细胞（图 4A） 。STZ 诱导的糖尿病大鼠 3mo后视网膜血管消化铺片免疫组织化学染色 -连环蛋白表达显著增加（图4B） 。图 4 胰蛋白酶消化的视网膜微血管 -连环蛋白表达 SABC200 A：对照组 B：糖尿病组2.5 STZ诱导的鼠视网膜 -连环蛋白水平 为了进一步证明 STZ诱导的糖尿病鼠视网膜在不同阶段 -连环蛋白水平的变化，Western blot分析结果显示糖尿病视网膜 N-钙粘蛋白在 4、8 和 12wk较对照组分别减少13.2, 15.8, 35.1（图 5） 。图 5鼠视网膜 -连环蛋白分析 N、G4、G8、G12 分别代表对照组、糖尿病 4、8 和
20、 12wk，条带的分子量为 92kDa，-actin 为内参照。*P0.05 与对照组相比3讨论糖尿病视网膜病变是糖尿病患者眼部视网膜微血管疾病，早期病理改变是视网膜微血管周细胞凋亡、血视网膜屏障的破坏，血管渗漏，导致这些改变的主要因素是高血糖6-8。我们通过免疫组化证明正常大鼠视网膜表达 -连环蛋白，主要分布在视网膜光感受器、外纵状层、内纵状层、神经节细胞层、内界膜及视网膜微血内皮细胞和周细胞。STZ 诱导的糖尿病大鼠，视网膜及微血管-连环蛋白表达显著增加，首次证明高血糖对视网膜及微血管 -连环蛋白的表达具有明显的影响。Western blot 分析表明随着糖尿病视网膜病变的发展 -连环蛋白
21、的表达显著增加。我们同样证明随着糖尿病视网膜病变的发展，视网膜血管渗透性显著增加。STZ 诱导的糖尿病血视网膜屏障的破坏最早发生在糖尿病诱导后 8d9，进一步说明 -连环蛋白的表达增加参与早期糖尿病血视网膜屏障的破坏和视网膜的功能障碍。血视网膜屏障的完整性是由紧密连接和黏附连接构成的密封的连接复合体和肌动蛋白细胞骨架决定的。钙粘蛋白-连环蛋白复合体连接到肌动蛋白细胞骨架10和与细胞外基质和细胞质分子包括细胞骨架和催化信号分子相互作用的整合蛋白介导的黏附连接给细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用提供强有力的保障11。钙粘蛋白-连环蛋白复合体不仅作为黏附连接而且作为细胞周围环境的生物传感器根据整
22、体器官的需要促进细胞监视有关相邻细胞的聚积和定位来调控细胞生物学行为的12。钙粘蛋白介导的黏附连结的调控是由与钙粘蛋白细胞质域相互作用的连环蛋白控制的。钙粘蛋白的细胞质域羧基端连接到 -连环蛋白，依次与 -连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架相联系。这些相互作用对正常的黏附系统的活性至关重要，因为 -连环蛋白对钙粘蛋白结构的构成和功能方面起关键的作用。因此 -连环蛋白的表达增加参与早期糖尿病视网膜血视网膜屏障的破坏和视网膜的损伤，可能通过所调控的黏附连接发生改变，尤其使视网膜微血管内皮细胞和周细胞之间相互作用及与细胞外基质的相互作用发生改变，细胞肌动蛋白细胞骨架重构，使视网膜血管屏障破坏；或者由于 -连
23、环蛋白的表达增加与周细胞的功能障碍和丧失有关，因为 STZ诱导的糖尿病鼠视网膜周细胞丧失在 48wk13，而-连环蛋白过表达能诱导肿瘤抑制蛋白 p53的聚集14或 -连环蛋白直接结合到 FOXO且增强 FOXO的转录活性15，进一步促进周细胞的凋亡。周细胞功能障碍或丧失失去对内皮细胞的调控，从而可能引起血视网膜屏障功能改变。总之，本实验研究首次证明 STZ诱导的糖尿病鼠视网膜及其微血管 -连环蛋白的表达增加且参与早期糖尿病视网膜病变发展，有助于进一步理解糖尿病视网膜微血管病变的发病机制。【参考文献】1 Gerhardt H, Betsholtz C. Endothelialpericyte i
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