1、-连环素在白血病细胞株的异常定位研究【摘要】 -连环素是 Wnt 信号通路关键的信号传递子，其在细胞的异常定位引起下游靶基因的转录是多种实体肿瘤发生的原因之一。由于造血细胞缺少典型的黏着连接（adherens junction,AJ） ，因此对-连环素在血液肿瘤的表达及定位并无较多的研究。本研究探讨 4 种常见的白血病细胞株(Daudi, Jurkat, K562 和 Thp-1)中 -连环素蛋白的定位及 -连环素基因 mRNA 的表达水平，了解血液肿瘤中是否有 -连环素蛋白的定位异常，以期发现白血病新的发生机制，为寻找新的特异治疗靶点提供线索。用免疫细胞化学法检测 -连环素在白血病细胞系中的
2、定位，用实时定量 RT-PCR 法测定 -连环素 mRNA 表达水平。结果表明：4 种白血病细胞株有两种（Jurkat、Thp-1）存在 -连环素的异常定位，且 -连环素 mRNA 表达增高，但在 Jurkat 和 Thp-1 细胞中的 -连环素mRNA 低于 Daudi 和 K562 细胞。这 4 种白血病细胞株中 -连环素基因的mRNA 表达水平与其异常定位无相关性。结论：-连环素定位异常可能参与部分血液肿瘤的发生，引起 -连环素定位异常的机制并不是发生在转录水平。 【关键词】 -连环素 白血病细胞株 Daudi K562 Jurkat Thp-1Aberrant Localization
3、 of -catenin in Leukemia Cell LinesAbstract-catenin plays a central role in Wnt signaling pathway. The aberrant localization of -catenin in nucleus causes the transcription of down-stream target genes, which is the pathogenesy of some solid tumours. As the expression of adheren junction on hemopoiet
4、ic cells is very low, there are a few studies on -catenin expression in leukaemia. This study was aimed to investigate -catenin localization and -catenin mRNA expression levels in 4 leukemia cell lines so as to explore a new oncogenic mechanism and to find out a new therapeutic target. The -catenin
5、localization in leukemia cell lines was detected by immunocytochemistry, the -catenin mRNA expression level was assayed by real-time quantitative RT-PCR. The results showed that there was aberrant localization of -catenin in Jurkat and Thp-1, and -catenin mRNA expression level was not increasd in th
6、ese two cell lines, however, the mRNA expression levels of Jurkat and Thp-1 were lower than those of Daudi and K562. The -catenin mRNA expression level was not correlated with -catenin aberrant localization in these 4 cell lines. It is concluded that the aberrant localization of -catenin may play a
7、role in the development of some leukemia, and the mechanism resulting in -catenin aberrant localization not take place at transcription level.Key words-catenin；leukemia cell line；Daudi；K562；Jurkat；Thp-1-连环素（-catenin）是 Wnt 信号通路关键的信号传递子，其在胞浆中的稳定、积累及进核是 Wnt 信号传递的重要步骤。它通过与胞核中 DNA 结合蛋白 TCF/LEF 的结合，共同调控一系
8、列与细胞分化、增殖相关的基因（如 c-myc、c-jun、cyclin D11等）的表达。-连环素在实体肿瘤中的作用已经得到了广泛的研究。已证实，-连环素的异常表达与多种实体肿瘤（如结肠癌、肝癌、黑色素瘤2-4等）的发生、发展相关。也有研究证实，Wnt 信号通路在造血干细胞的生长发育中起重要的作用5 。因此白血病中也可能存在 -连环素的异常表达。为了解不同白血病细胞株的 -连环素的表达状态，我们通过免疫细胞化学和实时定量 RT-PCR 技术对不同白血病细胞株的 -连环素的定位及转录水平进行研究。材料和方法细胞培养白血病细胞株 Daudi （人 Burkitt 淋巴瘤细胞系） 、Jurkat（急
9、性 T 淋巴细胞白血病细胞系） 、K562（慢性髓系白血病细胞系）、Thp-1（人单核细胞白血病细胞系）均购自华中科技大学同济医学院细胞库。所有细胞株均用 RPMI 1640 培养液（含 10胎牛血清）在 37、5 CO2、饱和湿度的孵箱内培养。主要试剂 兔抗人 -连环素抗体购自武汉晶美生物工程有限公司、SP 免疫组织化学试剂盒、DAB 显色试剂盒购自武汉凌飞生物技术开发有限公司，TRIzoL 总 RNA 提取液购自 Omega 公司，逆转录试剂购自 Promega 公司，PCR 试剂购自武汉天源生物技术有限公司，20SYBR Green染料购自上海复兴公司，兔抗人 -连环素抗体为 Neoma
10、rks 公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体为 Santa Cruz 公司产品。-连环素在白血病细胞株定位的免疫细胞化学检测取 Daudi、Jurkat、K562、Thp-1 细胞悬液，分别移入 10 ml 离心管中 600 g 离心 10 分钟，弃上清，用 PBS 洗涤细胞 1 次，再用 PBS 重悬细胞，调整细胞密度 105/ml 以上，进行细胞涂片（载玻片经 APES 处理） ，干燥后浸入-20预冷的甲醇中固定 20 分钟，风干后 4保存。取正常人外周血 Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，PBS 洗涤1 次，再用 PBS 重悬细胞，调整细胞密度 105/ml
11、 以上，进行细胞涂片，作为正常对照组。取各组细胞涂片，以 0.01 mol/L PBS 漂洗 3 分钟，共3 次；用 0.3过氧化氢/甲醇液室温孵育 30 分钟，以除去内源性过氧化物酶，用 PBS 漂洗 5 分钟，共 3 次；10正常山羊血清室温下孵育 10 分钟以减少背景非特异性染色；弃去血清，不洗，加稀释的一抗，4湿盒内过夜，PBS 漂洗 5 分钟，共 3 次；加入辣根过氧化物酶标记的通用型二抗，室温孵育 30 分钟，PBS 漂洗 5 分钟，共 3 次；DAB 显色，苏木素对比染色 30 秒，自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明，以中性树脂封固。油镜下观察结果。-连环素 mRNA 表达水平
12、的实时定量 RT-PCR 检测利用 SYBR Green染料在 LightCycle 荧光定量 PCR 仪上检测 -连环素 mRNA 的表达。取 5106 个细胞，用 TRIzoL 试剂提取总 RNA，逆转录合成 cDNA。参照文献5 ，设计引物，扩增产物为 71 bp，以 GAPDH为内参照，扩增产物为 220 bp。引物由上海博亚生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：-连环素：Sense：5-CCGCATGGAAGAAAT AGTTGAAG-3；Antisense：5-CAATTCGGTTGTG AACATCCC-3（GenBank NM_001904） ；GAPDH： Sense：5-
13、GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3； Antisense： 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3；(GenBank AJ005371)。SYBR Green是一种只与双链 DNA 结合的染料，当它与 DNA 双链结合时，发出荧光，从 DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，随着 PCR 产物的增加，产物与 SYBR Green结合的量也增大，其信号强度代表了产物的量，并做融解曲线对 PCR 产物的特异性进行鉴定。优化的实时定量 RT-PCR 体系为：10PCR 缓冲液 2 l，25 mmol/L MgCl2 2 l，10 mmol/L dNTP 0.4 l，20SY
14、BR Green 1 l， 10 mol/L 的引物各 0.4 l，2 U/l 的 Taq 酶 0.5 l，cDNA 1 l ，反应总体积 20 l。反应条件：95 3 分钟，94 5 秒，54 5 秒，72 10 秒，共 40 个循环，80采集荧光信号。标准曲线的制作将一次逆转录的 K562 细胞 cDNA 分装，保存于-80，作为标准品。每次扩增时拿出 1 份 K562 细胞 cDNA 用水做 10 倍系列稀释，分别对 -连环素和 GAPDH 进行实时定量扩增，制作各自的标准曲线。横坐标相当于 K562 细胞的总 RNA 量，纵坐标为 Ct 值（指 PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进
15、入指数增长阶段的拐点所对应的循环数） 。标准曲线相关系数 r0.99 的定量结果认为可靠。根据各自的标准曲线，可以得出各个标本 -连环素、GAPDH 的起始拷贝数。我们将 -连环素与 GAPDH 拷贝数之比的 100 倍作为标准化 -连环素（-cateninN） ，即 -连环素N（-连环素 mRNA 拷贝数/GAPDH mRNA 拷贝数)100%。结果-连环素蛋白定位分析研究已知，-连环素在造血细胞中可定位于胞膜和（或）胞浆，表达的强度可高可低，但无胞核的染色5 ，本研究的正常对照组仅有胞膜和胞浆的染色，与文献结果相同。在本研究中涉及到的几种细胞株中可观察到 Jurkat、Thp-1 胞核的强
16、染色（为棕黑色） ，Daudi、K562 无胞核的染色，仅有胞膜和胞浆的染色（为棕黄色） ，且不同的细胞染色的强度也有强弱之分（图 1） 。标准曲线的建立分别将 -连环素和 GAPDH 不同浓度的倍比稀释模板进行定量PCR，所得的定量标准曲线分别为 CtGAPDH-4.093 log（GAPDH 拷贝数）+7.954、Ct-catenin=-2.711 log（hTERT 拷贝数）+17.99，相关系数分别为-0.99、-1.00。根据公式计算 4 种细胞株的标准化 -连环素（即-cateninN） 。上述 4 种细胞株的实时定量 RT-PCR 结果见图 2。讨论Wnt 信号传导通路是一种既可
17、影响基因表达又可影响细胞迁徙的信号通路。-连环素是该通路中重要的信号传递子，其在胞浆内的稳定、积累及进核是 Wnt 信号传递的重要步骤。-连环素是一种多功能胞浆蛋白，多发性结肠腺癌有不同的蛋白结合功能域。在 Wnt 信号通路中，-连环素与轴蛋白（axin） 、腺瘤性结肠息肉（adenomatous polyposis coli，APC）和糖源合酶激酶-3 （GSK-3）相互作用，形成复合物。无 Wnt 信号时，丝/苏氨酸激酶的 GSK-3 和酪蛋白激酶（casein kinase ，CK）对 -连环素氨基端双磷酸化，进而启动泛素系统降解 -连环素。而在有 Wnt 信号时，信号传到细胞内，激活胞
18、浆内的散乱蛋白（dishevelled protein，Dsh） ，抑制 GSK-3 的活性，-连环素不能降解，而在胞内大量积累并进入核内，与 DNA 结合蛋白 TCF（T cell factor）/LEF(lymphoid enhancer factor)的结合，启动靶基因（如 c-myc、c-jun、cyclin D11等）的表达。研究结果表明：多种实体肿瘤的发生发展过程中常有异常的 Wnt 信号通路激活，而 -连环素的异常定位在实体肿瘤的发生中起重要的、直接的作用。在多种实体肿瘤中如结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝细胞癌中均可见到 -连环素在胞核的异常定位。业已证实实体肿瘤中 -连
19、环素在胞核的异常定位与实体肿瘤细胞的增殖、黏附等生物学活性相关3 。由于在造血细胞上缺少典型的黏着连接（adherens junction） ，-连环素在血液肿瘤的表达及定位并没有得到较多的研究，但已经证实，Wnt 信号通路确实参与到造血细胞的发育和增殖过程6 。由此可以推测，血液肿瘤细胞中可能存在 Wnt 信号通路的异常活化，可能有 -连环素的异常定位。本研究选择了 4 种常见的血液肿瘤细胞株进行研究，发现 -连环素在Daudi、K562 细胞中表达在胞膜及胞浆，但在胞核并没有观察到 -连环素的表达，而 Jurkat、Thp-1 细胞中可观察到 -连环素在胞核的表达。可以推断在 Jurkat
20、、Thp-1 细胞株中，-连环素在胞核异常表达，进而引起其下游一系列影响细胞周期的靶基因的过度表达可能在Jurkat、Thp-1 细胞株 的发生发展中起一定的作用。在部分血液肿瘤中存在有 Wnt 信号通路的异常活化，-连环素在胞浆内降解/积累调节失控、异常定位引起下游靶基因的转录是部分血液肿瘤发生的原因之一。研究已证实，在实体肿瘤中引起 -连环素异常表达的因素包括：-连环素本身表达水平的增高7 ；通过抑制 -连环素降解，进而上调-连环素的途径，包括 APC 蛋白、-连环素、GSK-3 的突变。APC 基因是一种典型的肿瘤抑制基因，与结肠癌发生的关系极为密切。在大多数结肠直肠癌中均发现 APC
21、基因突变，它的突变导致 APC 蛋白“去顶”改变，使其丧失与 -连环素、轴蛋白相互作用的功能，APC 蛋白的失活可直接导致 -连环素在核内的积累8 。在黑色素瘤、无 APC 基因突变的结肠癌和其它类型的肿瘤，如肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌等9肿瘤细胞中可检测到 -连环素（CTNNB1）基因的突变(主要发生在第 3 外显子)其氨基端的 Ser/Thr 磷酸化位点突变可影响其降解过程，造成 -连环素胞内水平升高。本研究进一步采用实时定量 RT-PCR方法定量检测 4 种细胞株中 -连环素基因表达水平，研究Jurkat、Thp-1 细胞株存在 -连环素异常定位的原因是否包括 -连环素基因表
22、达水平的增高。研究发现，Jurkat、Thp-1 细胞株的 -连环素基因表达水平并不比 K562、Daudi 高，而是比 K562、Daudi 的表达量更低。这提示 Jurkat、Thp-1 细胞株存在 -连环素的异常定位的原因并不是发生于 -连环素基因转录水平。可能会类似实体肿瘤，有 -连环素本身或者 Wnt 通路其它组分的突变，或其它原因引起的 -连环素在胞浆内降解/积累调节失控。具体引起 Jurkat、Thp-1 细胞株中 -连环素在胞核异常定位的原因仍需要进一步的研究。【参考文献】1 Karim R, Tse G, Putti T, et al. The significance of
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