1、 连环素在原发性肝细胞癌中的异常表达及其意义作者：申海军 顾红光 金世龙 【摘要】 目的 探讨 连环素(catenin) 在原发性肝细胞癌发生及发展过程中的异常表达及其意义。方法 应用免疫组织化学法检测 20例正常肝组织、20 例肝炎后肝硬化组织和 40例原发性肝细胞癌组织中catenin 的表达。结果 正常肝组织中的 catenin 几乎全部定位表达于细胞膜，细胞质中非常少见。31 例患者细胞膜上 catenin 表达缺失，缺失率为 77.5%(31/40)，26 例细胞质中有异位表达，异位表达率为 65%(26/40)。4 例肝炎后肝硬化患者细胞膜表达缺失，缺失率为20%(4/20)，9
2、例细胞质中有异位表达，异位表达率为 45%(9/20)。结论 catenin 异常表达对原发性肝细胞癌的发生及发展可能具有重要作用。【关键词】 连环素 原发性肝细胞癌 免疫组织化学【Abstract】 Objective To investigate the ectopic expression of the catenin and its significance in development of primary hepatocellular carcinoma. Methods The expression of catenin on mucosa of normal hepatic t
3、issues (20 cases), hepatitic cirrhosis (20 cases) and primary hepatocellular carcinoma (40 cases) was detected by means of immunohistochemistry technique. Results In normal hepatic tissues, catenin expressed mainly on the cellular membrane, with little expression in cytoplasm. In 40 cases with prima
4、ry hepatocellular carcinoma, there found decreased expression of catenin on cellular membrane in 31 cases, with decrease rate of 77.5% (31/40), and ectopic expression of catenin in mucosa in 26 cases, with ectopic expression rate of 65% (26/40). While in 20 cases with hepatic cirrhosis, decreased ex
5、pression of catenin on mucosa was detected in four cases, with decrease rate of 20% (4/20), but ectopic expression was found in nine cases, with ectopic expression rate of 45% (9/20), both of which were lower than that of normal hepatic tissues but higher than that of primary hepatocellular carcinom
6、a tissues. Conclusions During development of primary hepatocellular carcinoma, there is ectopic expression of catenin on cellular membrane and cytoplasm, which may play a pivotal role in development of primary hepatocellular carcinoma.【Key words】 catenin; Primary hepatocellular carcinoma; Immunohist
7、ochemistry原发性肝细胞癌是严重威胁人民群众健康的常见恶性肿瘤之一1 ，而肝炎后肝硬化又被视为肝细胞肝癌的癌前病变。近年来，许多研究发现 wnt信号通路与原发性肝细胞癌的发生发展有密切关系，连环素(catenin) 是 wnt信号通路中重要的蛋白。因此，catenin 可能在原发性肝细胞癌的发生发展中有重要作用。本实验采用免疫组化染色方法检测正常肝组织、肝炎后肝硬化组织和原发性肝细胞癌组织中 catenin 的表达情况， 旨在探讨 catenin 在原发性肝癌的形成、发展中的作用。1 材料与方法1.1 临床资料收集 2004年 10月至 2005年 12月我院手术切除的 40例原发性肝
8、细胞癌患者组织，其中男性 28例，女性 12例；平均年龄 52.4岁。正常肝组织 20例取自无肝炎病史、肝功能正常患者，行单纯胆囊切除术所取肝脏活检组织，女性 12例，男性 8例；平均年龄 45.3岁。肝硬化组织取自 20例肝炎后肝硬化、门静脉高压症行脾切除术、门 奇断流术患者，其中男性 14例，女性 6例；平均年龄 52.3岁。上述组织均经病理学证实。1.2 主要试剂鼠抗人 catenin 单克隆抗体，购自 Sigma公司，工作浓度为1100；二抗为 Power VisionTM(IgG抗体HRP 多聚体)复合物，购自北京中山生物制剂有限公司。1.3 方法采用免疫组化 Power Visio
9、nTM二步法：收集标本后甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为 4 m，烤干，二甲苯脱蜡，经 100%，95%，80%酒精梯度脱水，自来水漂洗，3%双氧水孵育 10 min，PBS 漂洗 5 min3，浸入 0.001 mol/L(pH6.0)枸橼酸盐缓冲液中，置于微波炉内中火(9298 )抗原热修复 15 min，冷却，PBS 漂洗 5 min3，滴加一抗(1100)，4 过夜，PBS 漂洗 5 min3，滴加增敏剂，37 热孵 30 min，加二抗，37 热孵 30 min，DBA 显色剂显色 530 min，苏木精复染 10 s，饱和碳酸锂 10 s，依次经 95%100%酒精脱水，吹干，封片，
10、镜下观察，照相，以 PBS作阴性对照。以细胞膜、细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达。判断标准按 Maruyama等2方法，观察细胞膜、细胞质表达情况，当细胞膜阳性表达77%为正常表达，反之为异常表达(异位表达或者有膜缺失)，细胞质阳性表达10%为异位表达。申海军，等. 连环素在原发性肝细胞癌中的异常表达及其意义 1.4 统计学处理采用 SPSS 10.0统计软件进行 2 检验。2 结果2.1 catenin 在正常肝组织中的表达正常肝组织中，细胞膜出现明显的棕黄色染色，细胞膜清晰可见，仅个别细胞的细胞质中出现较浅的棕黄色染色(图 1)。图 1 细胞膜清晰可见，细胞膜出现明显的棕黄色染色，细胞质中未
11、出现棕黄色染色 (Power VisionTM 染色 200)2.2 catenin 在肝炎后肝硬化组织中的表达肝炎后肝硬化组织中，可见完整的细胞膜，大部分细胞的细胞膜上有明显的棕黄色染色, 部分细胞的细胞质中出现棕黄色染色(图 2)。肝炎后肝硬化组织 20例中有 4例细胞膜表达缺失，缺失率为 20%，9 例细胞质中有异位表达， 异位表达率为 45%， 均低于正常肝组织， 高于原发性肝细胞肝癌组织。图 2 细胞膜上有明显的棕黄色染色，部分细胞的胞质中出现棕黄色染色 (Power VisionTM 染色 200)2.3 catenin 在原发性肝细胞癌组织中的表达原发性肝细胞癌组织几乎所有的细胞
12、膜未现棕黄色染色，细胞膜表达有明显的缺失，细胞膜结构因未着色几乎看不清楚，而大部分细胞质中出现清晰的深棕黄色染色(图 3)，细胞质的异位表达明显增加。在原发性肝细胞癌 40例中 31例的细胞膜上 catenin 表达缺失，缺失率为 77.5%，26 例的细胞质中有异位表达，表达率为 65%，明显高于肝炎后肝硬化组织。图 3 细胞膜结构因未着色，几乎看不清楚，细胞质中出现清晰的深棕黄色染色 (Power VisionTM 染色 200)catenin 在 3种组织细胞质的表达：肝硬化组织高于正常肝组织(P0.05)，肝癌组织明显高于肝硬化组织(P0.05)。catenin 在 3种组织细胞膜缺失
13、率差异有统计学意义(表 1)，肝硬化组织高于正常肝组织(P0.05)，肝癌组织明显高于肝硬化组织(P0.05)。表 1 catenin 在 3种肝组织中表达情况3 讨论近年来的研究发现在成年脊椎动物中 wnt基因与内环境和肿瘤的发生有密切关系3 。wnt 信号通路是一条控制动物胚胎发育及细胞命运的重要信号通路。wnt 基因控制 wnt蛋白合成，wnt 蛋白到达靶细胞时与靶细胞中的跨膜受体卷曲(frizzled)蛋白特异性结合，将信息传到细胞内，进入细胞内后，经 DSH蛋白传至 GSK3 并与其结合使其去磷酸化。GSK3 主要功能是降解 catenin ，使其在细胞质中的浓度降低，保持在低水平，
14、不能进入细胞核调控相关基因表达4 。当 GSK3 被抑制后，catenin 降解中断，细胞质中游离的 catenin 增多，增多到一定水平与 T细胞因子 4(Tcf4) 结合形成复合物，然后进入细胞核与Tcf/Lef(T cell transcripronal factor/Lymphoid enhancer factor)族含有 HMG盒(hight mobility group,DNA 结合区)的转录活化因子作用，调节 cmyc 、cyclin D1等靶基因的转录，推动细胞周期发展使细胞增殖加快和导致异常蛋白质产生，进而加速肿瘤形成和细胞癌变。因此catenin 是 wnt信号传导途径中的
15、关键因子。最近的研究5表明 catenin 基因的突变在人类多种肿瘤中出现，catenin 基因突变导致 catenin 的降解中断，在细胞质中积聚，导致肿瘤的发生。catenin 在细胞质中异位表达与大肠癌6 、卵巢癌7发生发展有密切关系，大肠癌、卵巢癌中 catenin 中普遍存在 catenin 的异位表达。在正常细胞中 catenin 分布于细胞膜上，与细胞间的黏附有关，同上皮钙黏蛋白(Ecadherin) 一致8 。在肝部分切除的动物模型中观察到 catenin 有所上调，为了增加细胞间的粘附9 ，其上调恰好与 Ecadherin 的下调一致，即 catenin 下调则 Ecadhe
16、rin上调10 。catenin 在细胞中与 Ecadherin 形成复合物并插入细胞膜，很少能游离于胞质中，在细胞质中保持低水平。本研究观察从正常肝组织肝炎后肝硬化原发性肝细胞癌的发展过程中 catenin 表达改变，结果显示在正常肝组织中 catenin几乎全部定位于细胞膜上，细胞核未见表达。肝硬化组织中 catenin细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均高于正常肝组织(P0.05)。在原发性肝细胞癌组织中 catenin 在细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均高于正常肝组织和肝硬化组织(P0.05)。这些结果表明在原发性肝细胞癌的形成过程中，catenin 逐渐由细胞膜转移至细胞质，并在
17、细胞质中聚集，胞质聚集到一定水平进入细胞核激活相关基因诱发肝细胞癌变，同时细胞膜上的 catenin 使细胞间的粘连减少，使肿瘤的生长和转移有了可能。这提示 catenin 异位表达与原发性肝细胞癌的发生、发展有密切关系，也可能是癌肿较易发生转移的重要原因之一。有报道11catenin 在细胞膜和细胞质重新定位在人类多种肿瘤中出现，catenin 由细胞膜到细胞质的异位是激活 wnt途径的关键步骤，wnt 途径的激活最终导致了原发性肝细胞肝癌的发生，而catenin 细胞定位的改变的主要原因是 catenin 基因的突变。有研究12显示前列腺癌的转移和患者的存活时间与 catenin 异位表达
18、率有关。本研究结果提示观察 catenin 的细胞膜和细胞质异位表达情况可以早期预测诊断原发性肝细胞癌，可能为肝癌的早期诊断提供了新的途径。【参考文献】1 Murray C J, Lopez A D. Mortality by cause for eight regions of the world: Global Burden of Disease StudyJ. Lancet,1997,349(9061):1269-1276.2 Maruyama K, Ochiai A, Akimoto S, et al. Cytoplasmic betacatenin accumulation as a
19、 predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancerJ. Oncology,2000,59(4):302-309.3 Andrei G, Wei W, Hajo D, et al. Dickopf1 is a member of a new family of secreted, proteins and functions in head in dutionJ. Nature,1998,391(6665):357-362.4 Moon R. Bowerman B, Boutros M, et al. The prom
20、ise and perils of wnt signaling through betacatenin J. Science,2002,2969(5573):1644-1646.5 de La Coste A, Romagnolo B, Billuart P, et al. Somatic mutation of the betacatenin gene are frequent in mouse and human hepatocellular carcinomasJ. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(15):8847-8851.6 Bissonnette M,
21、 Khare S, von Lintig F C, et al. Mutaton and nonmutatonal activation of p21 ras in rat colonic azoxymethane induced tumors:effects on mitogen activated protein kinase, cyclooxygenase2, and cyclin D1J. Cancer Res,2000,60(16):4602-4609.7 Fujioka T, Takebayashi Y, Kihans T, et al. Expression of Ecadher
22、in and betacatenin in primary and peritoneal metasatatic ovarian carcinomaJ. Oncol Rep,2001,8(2):249-255.8 谢斌，李晓武，董家鸿.cmet 、E 钙黏蛋白、 连环蛋白在肝细胞癌中的表达及意义J.消化外科，2006，5(1):62-66.9 Monga S P, Pediaditakis P, Mule K, et al. Changes in WNT/betacatenin pathway during regulated growth in rat liver regenerationJ
23、. Hepatology,2001,33(5):1098-10109.10Gottardi C, Wong E, Gumbiner B. Ecadherin suppresses cellular transformation by inhibiting betacatenin signaling in an adhesion indepemdent mannerJ. J Cell Biol,2001,153(5):1049-1060.11Van Aken E, De Wever O, Correia da Rocha A S, et al. Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancerJ. Virchows Arch,2001,439(6):725-751.12Aaltomaa S, Karja V, Lipponen P, et al. Reduced alpha and betacatenin expression predicts shortened survival in local prostate cancerJ. Anticancer Res,2005,25(6):4707-4712.
