1、白细胞介素-1 和瘦素对人子宫内膜细胞粘附分子-1 和金属蛋白酶 9 的影响作者：郝翠芳，郎翠红，沈肖方,王昕荣【摘要】 目的 探讨白介素 -1(IL-1)和瘦素(leptin)在体外培养的子宫内膜中对与着床密切相关的因子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和金属蛋白酶 9(MMP9)的影响。方法 建立子宫内膜体外培养模型，分别用不同浓度的 IL-1 和 leptin进行干预，并采用半定量 RT-PCR方法检测ICAM-1和 MMP9 mRNA的表达变化。结果 分别经不同浓度的 IL-1 和leptin干预后(0.1ng/ml 的 IL-1 除外)，ICAM-1、MMP9 mRNA较对照组相比表
2、达增加，且随浓度的升高，表达量呈上升趋势。结论 不同浓度的IL-1 和 leptin可以通过促进子宫内膜中 ICAM-1、MMP9 mRNA的表达，进而为胚胎着床做好了充分的准备。 【关键词】 白细胞介素-1;细胞间粘附分子-1;金属蛋白酶 9Abstract Objective In order to study the mechanism of the system of interleukin-1 and leptin on embryo implantation in the early stage, we have observed the expression of interce
3、llular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and metalloproteinase 9 (MMP9) intervened separately by different density of interleukin-1 (IL-1)or leptin which were closely related to the implantation in the cultured human endometrial cells of the mid-secretory phase.Methods The expressions of ICAM-1 and MMP9
4、in the medium of model which have been intervened by IL-1 or leptin were detected by semiquantitative real time polymerase chain reaction.Results The expressions of both ICAM-1 and MMP9 mRNA were increased with the increasing density compared with the control group.Conclusion Different amounts of IL
5、-1 and leptin can upregulate the expression of ICAM-1 and MMP9,thus they maybe make full preparation for embryo implantation.Key words interleukin-1;intercellular adhesion molecule-1;matrix metalloproteinase 9具有着床功能的胚胎和接受能力的子宫内膜在功能和形态上的同步性是胚胎着床的关键，而正常的子宫内膜主要在排卵后 610 天允许胚胎着床称为“种植窗期” ，这需要许多细胞因子如 IL-1
6、和 leptin的参与，本文通过不同浓度的 IL-1 和 leptin干预体外培养的分泌中期的子宫内膜，检测与胚胎粘附和侵入密切相关的 ICAM-1和 MMP9的表达变化，来探讨 IL-1 和 leptin对胚胎着床的影响。1 材料与方法1.1 标本来源子宫内膜标本取自因男方因素不孕在烟台毓璜顶医院生殖中心于分泌中期行诊断性刮宫的育龄期妇女，年龄 2733 岁，月经周期 2630天。刮取的子宫内膜立即放入盛有 DMEM-F12培养基(DMEM 培养基与 F12培养基 1：1 混合，含 10%胎牛血清，100U/ml 青霉素，0.2mg/ml 链霉素，以下简称 D-F培养基)的试管中，10min
7、 内进行分离培养。1.2 主要试剂细胞培养基(DMEM/F12)(Hyclone)、囊胚培养液(Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、胶原酶(sigma 公司)、胰酶(烟台赛尔斯公司)、双抗(烟台赛尔斯公司)、IL-1(Santa Cruz)、leptin(Peprotech)、TRIZOL(上海生物工程公司)、AMV 一步法 RT-PCR试剂盒(上海生物工程公司)、引物(表 1)均在华大基因合成。表 1 引物名称及序号1.3 实验方法1.3.1 子宫内膜细胞的培养1将所获取的内膜放入 4C含双抗的 PBS液中，反复冲洗 2次去掉血液和黏液;置培养皿中，用眼科剪将内膜组织剪成
8、1mm1mm1mm的组织小块;0.25g/L 的胶原酶 37消化 2h或 4过夜;反复吹打消化组织，1000r/min离心 10min,弃上清;再次加入培养基，吹打细胞，1000r/min离心 10min，弃上清;将沉淀组织加入少量培养液，用 100目的滤网过滤，并用 1ml注射器末端研磨，去除组织块，将滤液中的细胞计数，以5105/ml接种到细胞培养瓶中，24h 换液，待细胞达到 70%80%融合时进行干预。1.3.2 子宫内膜细胞的干预将细胞培养液换成分别含有 0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml 的 IL-1，1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml 的 leptin，且
9、均不含血清细胞培养液，共培养 48h后，弃上清，用 PBS冲洗 3遍后，加入 TRIZOL，待细胞裂解后，收集裂解液，放入液氮中保存，待检。1.3.3 总 RNA的提取将 1ml的 Trizol加入到 EP管(1.5ml)中，振荡溶解沉淀，室温下静置 5min;加入 0.2ml(为总体积的 1/5)的氯仿，盖好盖子。剧烈颠倒15s。然后室温下静置 10min;低温 4离心 12000g15min，离心后液体分为 3层：上层无色的为总 RNA，占 0.5ml左右体积; 中层白色膜状的薄层为蛋白质层，下层红色的为 DNA。小心地将上层液体吸出转移至另一1.5ml的 EP管中，加等体积的异丙醇，约为
10、 0.30.4ml。振荡混匀后室温下静置 10min(时间越长越好)，低温 4离心 12000g15min。在离心前 RNA通常不可见，但离心后可见 RNA呈白色片状附着在管壁底部，朝着附着的反方向小心倒出上层液体，边倒边注意是否 RNA还附着在壁上，剩余的水从附着的反方向用吸头吸去;加入 1ml 75% DEPC处理过的乙醇，垂直振荡后低温 4离心 8000g10min;同样方法移去上层液体，加入20l 的 DEPC处理过的水或 RNAase free的水。1.3.4 测 RNA的浓度、纯度取 2l RNA加 198l 的 DEPC处理过的水(稀释 100倍)，空白对照为 200l 的 DE
11、PC处理过的水，设测 A260的吸光度值，A260/A280 的值在 1.82.0 之间才有意义。1.3.5 RT-PCR 反应参照 AMV一步法 RT-PCR试剂盒说明书进行操作，其中 -actin的扩增条件：首轮变性 94 2min，变性 94 15s，退火 49 30s，延伸72 1min，终延伸 72 10min;MMP9的扩增条件：首轮变性 94 2min，变性 94 15s，退火 50 30s，延伸 72 1min，终延伸 72 10min;ICAM-1的扩增条件：首轮变性 94C 2min，变性 94 15s，退火55 30s，延伸 72 1min，终延伸 72 10min。样本
12、的扩增在 PCR仪中进行。1.3.6 电泳步骤称取固体粉末状的琼脂糖 1.5g倒入 1TAE电泳缓冲液 60ml的锥形瓶中，配制成 2.5%的琼脂糖液体，微波炉加热使其溶液沸腾，然后冷却至 5060，再加入 Goldviewna 型核酸染料 12l，摇匀，缓慢地将琼脂糖溶液倒入灌胶板中，放入“梳子”一把，室温放置，30min 后等琼脂糖胶完全凝固后拔出梳子。将凝胶连同灌胶板一起放入电泳槽中，加样孔一侧位于阴极，在加样孔里加入 5l PCR 产物和 6Buffcr 2l的混合物，然后正确连接电泳槽和电源，开始进行电泳，电压90100V，电流 2A，时间 30min。1.3.7 结果判定电泳好的琼
13、脂糖凝胶置于紫外透射反射仪下以 Marker为标准观察结果，并以 ICAM-1/-actin、MMP9/-actin 的灰度比值，且各样本均数间采用 F检验，以 P0.05为差异有显著性，以此来判断 ICAM-1和MMP9的相对表达量。2 结果图 A为分别经不同浓度 IL-1 和 leptin干预后 ICAM-1mRNA、MMP9 mRNA的表达情况，从左向右的条带分别为经 10ng/ml的IL-1、1ng/ml 的 IL-1、0.1ng/ml 的 IL-1、100ng/ml 的leptin、10ng/ml 的 leptin、1ng/ml 的 leptin干预后、对照组、100bp DNA m
14、arker的条带，图 C为与图 A相对应的 -actin 条带;图 B为分别经不同浓度的 IL-1 和 leptin干预后的表达情况，从左向右的条带分别为经 0.1ng/ml的 IL-1、1ng/ml 的 IL-1、10ng/ml 的 IL-1、对照组、1ng/ml 的 leptin、10ng/ml 的 leptin、100ng/ml 的 leptin干预后、100bp DNA marker 的条带，图 D为与图 B相对应的 -actin 条带。而分别经不同浓度 IL-1 和 leptin干预后 ICAM-1mRNA、MMP9 mRNA的相对表达情况，以 ICAM-1/-actin、MMP9/
15、-actin 的灰度比值来判定，图 E和图 F分别为 ICAM-1mRNA、从左到右条形图依次代表对照组、经 0.1ng/ml的 IL-1、1ng/ml 的 IL-1、10ng/ml 的 IL-1、1ng/ml 的 leptin、100ng/ml 的 leptin干预组的 mRNA表达情况。ICAM-1和 MMP9的相对表达量见表 1、表 2。图 A 图 B图 C 图 D图 E 图F表 1 不同浓度 IL-1 干预后 ICAM-1和 MMP9的相对表达量表 2 不同浓度 leptin干预后 ICAM-1和 MMP9的相对表达量3 讨论IL-1 是由活化的单核/巨噬细胞分泌产生的重要免疫调节因子
16、,具有广泛的生物学效应，可参与免疫调节介导炎症反应及致热作用，在正常生理条件下，卵细胞刺激素(FSH)在卵泡期促进血单核细胞分泌 IL-1，诱导卵细胞成熟，黄体生成激素(LH)能够促进 IL-1 在人黄素化颗粒细胞上的转录表达，调节卵巢表面糖皮质类固醇的生成。此外 IL-1 在胚胎着床中是主要的细胞调节剂,其通过自分泌/旁分泌方式调节生殖内分泌功能，而胚胎着床是一个复杂的生理过程，它包括早期胚胎的发育、子宫内膜容受性的建立、胚胎脱透明带、胚胎在子宫内膜上的粘附和植入等环节，涉及细胞的增殖、分化、生长发育、细胞间的相互识别和粘附、植入等作用。leptin 是肥胖基因的产物,由白色脂肪细胞分泌的一
17、种含 146个氨基酸的蛋白质。其编码基因为肥胖基因(ob)，位于人第 7号染色体上，主要参与调节食物摄入和能量平衡。对女性生殖功能来说,leptin 可能是代表能量状态足够的一个信号2,作用于中枢和外周器官,启动青春期,调节女性的生殖内分泌功能;Margetic 等3报道leptin通过调节下丘脑-垂体-性腺的功能影响性激素的合成和分泌，也可通过直接或间接的外周作用对生殖系统功能产生影响，抑或通过直接结合卵泡细胞膜表面瘦素受体影响细胞的功能，但其具体机制尚不明了。本实验通过体外培养子宫内膜细胞，观察不同浓度的 IL-1 和 leptin对与胚胎的粘附和侵入相关的 ICAM-1和 MMP9的影响
18、，来探讨其对胚胎着床的影响。ICAM-l(CD54)为细胞粘附分子中免疫球蛋白超家族的主要成员，ICAM-1由较复杂的细胞外区、疏水的跨膜区和较短的胞质内区构成。ICAM-1细胞外区由 5个免疫球蛋白(Ig)样结构组成，分别有 5个单独的外显子编码;跨膜区、信号肽和胞质尾区则分别有两个不同的外显子编码。ICAM-1蛋白分子含有 505个氨基酸，可以二聚体形式低表达于多种组织细胞的表面和细胞外基质，它分布广泛，在上皮细胞、内皮细胞、白细胞、巨噬细胞及成纤维细胞上都有表达，主要作用是介导细胞与细胞间的粘附，具有参与急性期炎症反应时的白细胞浸润、调节机体免疫等多种功能，且对胚胎着床过程中介导子宫内膜
19、容受性的建立和胚泡在子宫内膜的粘附发挥着重要作用。ICAM-1 在生理条件下表达水平较低;当受到炎性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)和干扰素 7(IFN-7)等刺激后 ICAM-1表达明显增多。Salafia 等4研究还发现，ICAM-l 在蜕膜细胞及滋养层细胞的表达与着床密切相关，参与母胎细胞群的相互作用。Burrows 等5研究发现 ICAM-1 mRNA在孕早期蜕膜和绒毛膜的血管内皮细胞上都有表达，它的同族成员血管细胞黏附分子(VCAM)的表达量还与着床位点有关。ICAM-1 在整个月经周期的子宫内膜的血管内皮中有规律性地表达，提示它可能参与了妊娠早期的生
20、理过程。本实验分别通过用不同浓度的 IL-1(除外 0.1ng/ml)和 leptin干预后ICAM-1的表达较对照组相比，mRNA 的表达量增加，且随着 IL-1 和leptin浓度的增加，呈现上升趋势。此外还有研究表明 ICAM-1在胚泡6上也有表达，可以通过与其配体如淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1)等结合来介导胚泡与内膜间的粘附，并且1CAM-1/IFA-1结合是母胎接合面免疫耐受和免疫整合的主要调节者7，ICAM-1/LFA-1对导致前炎性细胞因子迁移至着床位点，促使蜕膜的树突状细胞成熟，诱发局部辅助 T细胞(Th1)增加并参与母胎面的免疫耐
21、受形成，避免了子宫内膜对胚泡的免疫排斥作用，进而有利于胚泡的着床。此外还有学者通过 RT-PCR的方法研究8IL-1 可以上调小鼠子宫内膜细胞中 ICAM-1 mRNA的表达，增强胚胎的种植能力，提高着床率。故而通过本实验可以看出 IL-1 和 leptin通过上调 ICAM-1的表达，进而促进母胎面的免疫耐受形成和胚泡在子宫内膜的粘附。胚泡的植入是继在子宫内膜粘附后的重要环节，细胞外基质的降解又是胚胎植入过程中的关键步骤，而 MMP9是一族降解 ECM成分的中性含锌蛋白酶类，它可降解变性胶原分子及天然、型胶原。Leco等9发现 MMP9特异性高表达于着床部位，可能是参与胚胎着床过程中细胞外基
22、质降解的重要调节因素之一。 Castellucci10报道，当与胚胎侵入有关的 MMP9在局部浓度较高时，它可以发挥酶解作用消化蜕膜基质、基底膜，为胚胎绒毛外滋养细胞侵袭螺旋小动脉变异，加速完成血管重塑过程，较快建立子宫胎盘血液循环。李黎等11发现体外培养的分泌中期内膜细胞分泌的 MMP9是 IL-1 浓度依赖性的，不断增加IL-1 的浓度可引起 MMP9的表达量稳定增长，人子宫内膜基质细胞表面存在有 IL-1R,基质细胞通过自分泌/旁分泌等途径分泌 IL-1,与 IL-1R结合促进内膜细胞分泌 MMP9，降解胞外基质，有利于绒毛滋养层细胞侵入子宫内膜，促进胚胎着床。为了验证以上结论，本实验在
23、体外培养的子宫内膜中，分别用不同浓度 IL-1、lepitn 干预后采用半定量 RT-PCR的方法检测子宫内膜细胞 MMP9 mRNA的表达，结果提示：随着 IL-1、leptin 的干预浓度升高，可以促进子宫内膜细胞 MMP9的分泌增加，降解细胞外基质，有利于绒毛滋养细胞侵入子宫内膜，促进胚胎植入。笔者认为，在体外不同浓度的 IL-1 和 leptin能促进子宫内膜细胞 ICAM-1和 MMP9的表达，有利于胚胎粘附和植入，为提高体外受精-胚胎移植过程中胚胎种植率和临床妊娠率，提供有价值的理论依据。【参考文献】1 秦海燕，王京磊.子宫内膜细胞培养方法的研究.实用临床医学，2007，8(10)
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