1、参附注射液、高乌甲素注射液诱导白血病细胞株 HL-60 分化、凋亡的研究作者：伍耀衡, 宁异真, 许建邦, 谭宇蕙, 吴映雅, 严定安, 吕国全 【摘要】 【目的】观察参附注射液及高乌甲素注射液诱导白血病细胞株 HL-60 分化、凋亡的作用，初步验证温阳法治疗肿瘤的理论。 【方法】采用人类急性白血病细胞株 HL-60 为模型，设参附注射液组（终浓度分别为 12.5、25、50、100L/mL）,高乌甲素组（终浓度分别为25、50、100L/mL） ，亚砷酸钠对照组（终浓度分别为0.25、2、15mol/L）及阴性对照组；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡
2、率等指标。 【结果】参附注射液作用后 HL-60 细胞增殖受抑制，高乌甲素注射液对 HL-60 的生长无抑制作用；经药物处理 60h 后 HL-60 细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5L/mL） 、高乌甲素注射液（50L/mL）作用 60h 后 HL-60 细胞 NBT 还原能力增强，而其他浓度组 NBT 还原能力反未增强；药物处理 60h 后，100L/mL 高乌甲素液及25.50L/mL 参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。 【结论】参附注射液、高乌甲素注射液对人类急性白血病细胞株 HL-60 具有不同程度的诱导分化和凋亡的
3、双重作用，为温阳法治疗肿瘤提供了一定的理论依据。 【关键词】 参附注射液药理学； 高乌甲素注射液药理学； 白血病中药疗法； 肿瘤细胞病理学； 细胞凋亡；细胞培养 近年来中医药抗肿瘤研究领域根据内经 “积之始生，得寒乃生，厥乃成积” 、 “阳化气，阴成形”的理论，逐步重视温阳法的研究1-5 。乌头碱、人参皂苷类物质抗肿瘤的研究也逐渐开展，在常用的中药中，温阳作用效强力专者首推附子类药物，其中所含乌头碱类物质是其主要效应成分。结合我们临床应用温肾法为主治疗肿瘤经验，本文从诱导分化、凋亡角度，观察临床常用的温阳法代表针剂参附注射液及乌头碱类药物高乌甲素（拉巴乌头碱、刺乌头碱）注射液对人类急性白血病细
4、胞株 HL-60 的作用，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 主要药物 参附注射液每毫升相当于生药红参 0.1g,附片0.2g，由雅安三九药业有限公司生产（批号：20043116） ；氢溴酸高乌甲素注射液（2mg/mL，由广州天心药业股份有限公司生产 ，批号：040501） ；亚砷酸氯化钠注射液由哈尔滨伊达药业有限公司生产（批号：20050302） 。以上药物均购自广东省中医院药房，临用时以磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释。 1.2 主要试剂 二甲基亚砜（DMSO） 、四甲基偶氮唑盐（MTT）均由Sigma 公司生产；Wright-Giemsa 混合染液由广州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由 C
5、lbiochem 公司生产；硝基四氮唑蓝（NBT）由 Mbchem 公司生产；碘化丙啶（PI）染色液由 Becton Dickinson 公司生产。 1.3 主要仪器 Bio-Rad-450 型全自动酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品；150-400 型细胞培养箱为英国 Biotech 公司产品；3169 型倒置显微镜为日本 Nikon 公司产品；SW-CJ-IF 型超净工作台为苏州净化设备厂产品；TGL-16 型高速冷冻离心机为德国 Sigma 公司产品；NexPower1000型纯水器为韩国 Human Corp 产品； FACSCalibur 型流式细胞仪为Becton Dickin
6、son 公司产品；普利生 MIAS 2000 型智能骨髓图像分析系统为北京深圳普利生公司产品；Nikon E200 型普通光学显微镜为日本Nikon 公司产品。 1.4 细胞模型 HL-60 细胞株购自中山大学动物中心细胞库，在广州中医药大学基础医学院生化教研室实验室传代培养。实验时取对数生长期细胞， 2g/L 台盼蓝拒染实验证实活细胞数大于 95%，并调整实验时所需密度。 1.5 实验方法和检测指标69 1.5.1 分组 设参附注射液、氢溴酸高乌甲素注射液实验组（简称参附液组、高乌甲素组） ，在实验的不同阶段，参附液组终浓度分别为12.5、25、50、100L/mL，高乌甲素组终浓度分别为2
7、5、50、100L/mL，亚砷酸钠对照组则取 0.25、2、15mol/L 3 个浓度。并设空白（本底）对照组、阴性对照组。 1.5.2 细胞加药培养 在实验的不同阶段，按相应的设计要求接种制备好的细胞悬液到 12 或 96 孔培养板中（每孔细胞量见具体项目） ，分别加培养基及药物。96 孔培养板中每孔加含体积分数为 15%小牛血清的RPMI-1640 培养基 180L，然后按不同浓度加药，最后不足 200L 的孔则用 PBS 补足至每孔总体积为 200L；12 孔培养板中每孔加含体积分数为 15%小牛血清的 RPMI-1640 培养基至终体积 2.5mL,再按不同浓度加药。然后分别置入 37
8、、体积分数为 5%CO2 饱和湿度条件下的细胞培养箱培养。每天将接种好的培养板取出置于倒置显微镜下观察 12 次，以及时掌握细胞生长状况。 1.5.3 不同药物及浓度对 HL-60 细胞生长的影响 参附液、高乌甲素各设 3 个不同的药物浓度组，以细胞终浓度为 2104/mL 接种到 96 孔培养板中，培养 48h 后采用 MTT 法检测各组存活率、半数抑制浓度（IC50） 。 细胞增殖抑制的 MTT 测定：加药培养后每孔加入 5g/L 的 MTT 溶液20L，在细胞培养箱孵育 4h 后取出，用 1.5mL 离心管离心去上清，每管加 DMSO 150L，按原顺序放回 96 孔板轻轻震荡 15mi
9、n,采用酶标仪在570nm 波长下测定各孔 D 值，根据下列公式计算细胞存活率：p 细胞存活=（D 加药组/D 对照组）100%；根据文献6 方法计算 IC50。 1.5.4 不同作用时间对 HL-60 细胞生长的影响 参考 1.5.3 的结果，取 96 孔板接种细胞。高乌甲素组设终浓度为 50L/mL，参附液组设终浓度为 50L/mL，细胞终浓度为 2104/mL，分别在培养 24、48、72h 取出相应培养板，按上法进行 MTT 检测。计算各组存活率，绘制生长曲线。1.5.5 细胞形态观察 进行 1.5.3、1.5.4 指标检测时每天将接种好的培养板取出，置于倒置显微镜下观察细胞生长状况
10、12 次。 12 孔板中每孔接种 2105 个细胞培养 60h 后用 PBS 漂洗 2 次后，以体积分数为 70%的乙醇将细胞固定后收集固定细胞涂片，吹干， Wright-Giemsa 混合染液及甲基绿派诺宁染色，晾干后普通光学显微镜下，观察 200 个细胞进行分类计数，智能骨髓图像分析系统拍照记录。 1.5.6 NBT 实验（还原反应比色法） 以每孔 3103 个细胞接种到96 孔板中培养 5d 后，1 000r/min 离心 5min 收集细胞，再将细胞悬浮于200L /孔的 NBT 溶液中（内含 0.24g/mL 的 TPA） ，放入培养箱中培养1h，细胞离心去上清液，每孔加入 200L
11、 DMSO，室温下震荡 20min，在570nm 波长下测定 D 值。 1.5.7 流式细胞仪检测细胞周期分布、凋亡率 12 孔板中每孔接种2105 个细胞培养 60h，用 PBS 漂洗 2 次，调整细胞至 1106 个/mL，再加体积分数为 70%的乙醇（-20 ）固定细胞过夜后，上流式细胞仪以PI 单染法检测细胞周期分布、凋亡率。 1.5.8 统计学处理 采用 Microsoft Excel 软件进行统计分析。 2 结果 2.1 不同药物、浓度及作用时间对 HL-60 细胞的影响 2.1.1 不同浓度参附液和高乌甲素作用 48h 对 HL-60 细胞生长的影响 表 1、图 1 结果显示，参
12、附液对 HL-60 细胞生长有明显抑制作用，且呈现一定的浓度依赖性，作用 48h 半数抑制浓度（IC50）约为 68L/ mL；而高乌甲素对 HL-60 的生长无抑制作用。 表 1 不同浓度的药物作用 48h 对 HL-60 细胞生长的影响（略） Table 1 Effect of SI and LHI at different concentrations on HL-60 cell growth after culturing for 48 hours 统计方法：t 检验；.，与阴性对照组比较 2.1.2 各药物不同作用时间对 HL-60 细胞生长的影响 根据.1 结果，取参附液终浓度 5
13、0L/ mL 及高乌甲素终浓度0/ mL 连续测定药物作用 24、48、72h 对 HL-60 细胞生长的影响，表 2、图2 结果显示参附注射液对 HL-60 有明显的生长抑制作用，且呈现一定的时间依赖性；高乌甲素对 HL-60 的生长无抑制作用。 图 1 不同浓度药物作用 48h HL-60 细胞生长曲线（略） Figure 1 Growth curve of HL-60 cells in various groups after culturing for 48 hours 图 2 各药物不同作用时间 HL-60 细胞生长曲线（略） Figure 2 Growth curve of HL-
14、60 cells in various groups after culturing for 24,48 and 72 hours 2.2 细胞形态观察 2.2.1 倒置显微镜下的细胞形态 加药培养 24h 各组细胞数目均有增加，生长状态良好，胞膜完整；48h 后阴性对照组和高乌甲素组的细胞数目继续增加，而参附液组细胞生长受到抑制，不同浓度差异较大，高浓度组细胞出现明显皱缩或崩解，低浓度组细胞大部分完整，少数出现胞膜不完整，中浓度基本介于高低之间；72h 后阴性对照组和高乌甲素组细胞数目仍在增加，胞膜尚完整，胞浆透明，而参附液组细胞数明显减少，胞膜不完整，胞浆颗粒增多，碎裂细胞明显增多，与 M
15、TT 测定结果一致。 2.2.2 Wright-Giemsa 混合染色的细胞形态 培养 60h 后，细胞经Wright-Giemsa 混合染色后形态大致分为 4 类：基本保持原始粒细胞形态；出现轻度分化、凋亡、退变特征的细胞；比较明显的凋亡特征：体积缩小，胞浆着染变浅不均匀，有空泡变性，胞膜不规则、皱缩，核染色质浓聚，形状不规则，染色质分布不均匀，或固缩，核仁不明显或消失，类似临床血液细胞学“固缩退变细胞” ；类似临床血液细胞学“肿胀退变细胞”的细胞：体积增大肿胀，胞浆着染变浅不均匀，有空泡变性，胞膜不规则、不完整，染色质浓聚而核肿胀，形状不规则，分布不均匀，核仁不明显或消失。罕见明确对应原始
16、粒细胞以下的粒单系细胞分化成熟各阶段分类特征的细胞，亦罕见核碎裂和凋亡小体，仅偶见固缩细胞中有类似已进入终末分化的中性粒细胞（晚幼粒细胞、杆状核细胞、分叶核细胞）的细胞。细胞形态变异见图 3，各种形态细胞大致分类见表 3。 表 3、图 3 结果显示经药物处理后 HL-60 细胞出现了部分类似于凋亡、分化的变异，尤以参附液组较明显，高乌甲素组较弱，与倒置显微镜观察结果大体一致。 表 2 各药物作用 24、48、72h 对 HL-60 细胞生长的影响（略） Table 2 Comparison of HL-60 growth in various groups after culturing fo
17、r 24,48 and 72 hours 统计方法：t 检验；.,与阴性对照组比较 表 3 药物作用 60h 后 HL-60 细胞形态特征变化分类（略） Table 3 HL-60 cell morphological classification in various groups after culturing for 60 hoursp 表 4 不同浓度的药物对 HL-60 细胞 NBT 还原能力的影响（略） Table 4 Comparison of NBT reduction ability of HL-60 in different groups 统计方法：t 检验；.，与阴性对照
18、组比较 2.2.3 甲基绿派诺宁染色的细胞形态 甲基绿派诺宁染色标本见各组细胞形态大致与 Wright-Giemsa 混合染色标本相同，大部分细胞浆呈红色着染，因而类细胞、类细胞都可视为凋亡细胞。细胞形态变异见图 4。 2.3 NBT 实验 不同浓度的药物对 HL-60 细胞 NBT 还原能力的影响见表 4。结果显示 50L/mL 的高乌甲素、12.5L/ mL 的参附液作用 60h后 HL-60 NBT 还原能力增强，而 100L/mL 高乌甲素和 25、50L/mL 的参附液以及亚砷酸钠各浓度作用 60h 后 HL-60 NBT 还原能力未增强。 2.4 不同浓度药物作用后对 HL-60
19、细胞的周期分布及凋亡率的影响 表 5 结果显示，各药物作用对 HL-60 细胞的周期分布无明显影响；100L/mL 的高乌甲素及 25、50L/ mL 的参附液作用 60h 后 HL-60 细胞凋亡率较阴性对照组有所增高，流式细胞仪检测直方图（图 5）可见亚二倍体凋亡峰。 表 5 药物作用 60h 对 HL-60 细胞周期分布及凋亡率的影响（略） Table 5 Effect of SI and LHI on HL-60 cell cycle and apoptotic rate after culturing for 60 hours a.阴性对照组（原始粒细胞）b.25L/mL 参附液组（
20、肿胀退变细胞和固缩退变细胞）c.50L/mL 参附液组（固缩退变细胞）d.100L/mL高乌甲素组（轻度变异细胞） 图 3 不同浓度药物处理 60h 后 HL-60 细胞形态（Wright-Giemsa 混合染色，100） （略） Figure 3 HL-60 morphological features in different groups after culturing for 60 hours （Wright Giemsa stain,100） a.阴性对照组（原始粒细胞）b.25L/mL 参附液组（肿胀退变细胞和固缩退变细胞）c.50L/mL 参附液组（肿胀退变细胞和固缩退变细胞）d
21、.100L/mL 高乌甲素组（轻度变异细胞） 图 4 不同浓度药物处理 60h 后 HL-60 细胞形态（甲基绿派诺宁染色,100） （略） Figure 4 HL-60 morphological features in different groups after culturing for 60 hours （UNNA stain,100） a.阴性对照组 b.25L/mL 参附液组 c.50L/mL 参附液组d.100L/mL 高乌甲素组 图 5 不同浓度药物处理 60h 后 HL-60 细胞流式细胞仪检测直方图（略） Figure 5 Flowcytometry graph of H
22、L-60 after culturing for 60 hours in different groups 3 讨论 本观察结果显示参附液具有抑制 HL-60 细胞增殖的作用，高乌甲素短期作用无抑制 HL-60 细胞增殖的作用；参附液、高乌甲素在一定的浓度范围内具有诱导 HL-60 细胞分化、凋亡作用，且其作用互相重叠，趋向于低浓度下以诱导分化为主，高浓度下以诱导凋亡为主，其中参附液作用较强，与文献6高乌甲素诱导 HL-60 细胞分化、凋亡作用较弱结果一致。本文结果与有关人参皂苷10-14 、乌头碱类物质2,15-17的相关研究大致相符。 高乌甲素作用后 HL-60 细胞存活率未见降低，甚至1
23、00%,结合细胞形态检测，并根据粒细胞的自然生长规律，考虑此时 HL-60 细胞被诱导后至多分化到中幼粒细胞阶段，细胞增生仍较旺盛；12.5L/ mL 参附液组、50L/mL 高乌甲素组 NBT 还原能力增强，提示低浓度下具有一定诱导 HL-60 细胞分化作用，而 25、50L/mL 参附液组，100L/mL 高乌甲素组 NBT 还原能力未增强反而下降，结合增殖抑制测定、细胞形态检测，主要考虑该较高浓度组细胞已死亡、标本总体酶活性下降所致，但不能排除仍存活的细胞有较高的 NBT 还原率；阳性对照药物亚砷酸钠的诱导分化、凋亡作用已为国内外一致公认，虽定位为西药制剂，但砷剂亦为传统中药，其性大辛大温。虽然亚砷酸钠对 HL-60 细胞作用的报道有较大差异，但其对 HL-60 细胞的 NBT 还原能力无影响18 ，本研究结果与之一致，且中、高浓度亚砷酸钠组 NBT 还原能力下降，考虑是缘于细胞死亡，甚至是非特异性作用。 另外，药物作用后凋亡率偏低，与形态观察细胞变异似乎形成较大差异，考虑可能跟 PI 单染检测方法（主要检测凋亡晚期细胞）有关，其
