1、丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系【关键词】 ,C 型肝炎病毒属 关键词: C 型肝炎病毒属;癌，肝细胞;蛋白表达 摘 要:目的 探讨丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系及其意义. 方法 采用免疫组织化学方法检测 HCV 核心区抗原和 NS3 区抗原在肝硬变（LC）和肝细胞肝癌（HCC）组织中的分布，同时对连续切片进行原位凋亡检测并计算凋亡指数. 结果 HCV 核心区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质或胞核中，在 LC 组织中，核心抗原呈弥漫或灶状分布于肝细胞胞质，偶见胞核阳性的肝细胞，阳性率为 60.7%;核心抗原在癌组织中以核阳性分布为主，阳性率为 37
2、.6%，癌旁肝组织以胞质阳性为多见.HCC 中 HCV 核心抗原的核阳性率（75.0%，15 例/20 例）明显高于其在 LC（17.7%，6 例/34 例）及癌旁肝组织（11.8%，2 例/17 例）中的阳性率（P0.05）;在 HCC 中，HCV 核心抗原核转位表达的癌组织的 AI 值（0.1740.093）显著低于胞质阳性的癌组织（0.5120.113，P0.01）.HCV NS3 区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质中，在 LC 和 HCC 组织中的阳性率分别为 53.6%和 39.6%.未发现HCV NS3 区抗原的表达与肝（癌）细胞凋亡的相关性. 结论 HCV 感染与我国 LC，HC
3、C 的发生关系密切，HCV 核心抗原在肝癌组织中常发生核转位表达，这种核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡，从而促进肿瘤组织的进一步恶化. Keywords:hepatitis C-like virus;carcinoma，hepatocellular;protein expression Abstract:AIM To analyse expression of HCV core protein and apoptosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of liver cirrhosis and hepatocellular carci
4、noma.METHODS Immunohistochemistry method was used to show the dis-tributive pattern of HCV core and NS3antigen.Modified in situ end labeling（ISEL）was conducted on the serial sections.RESULTS Immunohistochemistry showed expression of HCV core protein in the liver cirrhosis of34/56cases and HCC of20/5
5、3cases.In liver cirrhosis and pericancerous tis-sues，the signals were mainly localized in the cytoplasm of hepatocytes.ISEL showed that only cells expressing core protein might initiated apoptosis.In cancerous tissues，translocated expression of HCV core protein was observed in the nuclei of tumor ce
6、lls.According to ISEL on serial sec-tions，all these positive tumor cells hardly exhibited apoptosis（AI for nuclear positive，0.174vs AI for cytoplasmic posi-tive，0.152，P0.01 ）.HCV NS3antigen was mainly dis-tributed in the cytoplasm of hepatocytes.We could hardly found the relationship between the exp
7、ression of NS3and apoptosis in hepatocellular carcinoma.CONCLUSION HCV core protein may express in the nuclei of tumor cell.Translo-cated expression of HCV core protein may inhibit apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma. 0 引言 自 1989 年 Choo 等克隆出丙型肝炎病毒（HCV）以来，各国学者从分子病理和免疫病理的角度寻找 HCV 与宿主相互
8、作用的关系，进行 HCV 特异性抗原的表达与 HCV 相关性肝疾病之间关系的研究，证实 HCV 感染是肝硬变（LC） 、肝细胞肝癌（HCC）发生的一个重要危险因素1 .肝（癌）细胞的凋亡与 HCC 的发生和发展有着密切的联系.研究表明 HCV 的感染与肝（癌）细胞的凋亡有关2 .HCV 核心区和 NS3 区基因编码的蛋白具有较高的保守性.我们采用 ABC 法，对 HCV 核心区和 NS3 区抗原在LC，HCC 组织中进行定位研究，进一步探讨 HCV 与 HCC 发生的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 均为我院 1994/1996 年外科手术切除标本，其中 LC56 例，HCC53 例，45
9、 例带有癌旁肝组织.所有标本经 100mLL-1 福尔马林固定、脱水，常规石蜡包埋，制备 5m 厚连续切片，APES 胶（Sigma，USA）对玻片进行处理以防脱片.HCV 核心区抗原 2B 株单克隆抗体由军事医学科学院基础所惠赠.HCV NS3 区抗原单克隆抗体由北京医科大学人民医院肝病研究所惠赠. 1.2 方法 采用 Vector Lab 公司生产的 ABC 试剂盒对石蜡切片经常规脱蜡至水后，进行免疫组织化学染色，根据操作手册进行，并做对照实验.连续切片进行 HE 染色.原位凋亡检测技术采用武汉博士德公司生产的原位末端标记试剂盒，根据操作手册和已有文献3进行，显微镜观察，对福尔马林固定石蜡
10、包埋的组织片采用蛋白酶 K（20mgL-1 ，15min，RT）消化和微波预处理.阴性对照为省去末端标记反应液，阳性对照用 0.5gL-1 DNA 酶 I（Sigma，USA）预先处理组织.结果判定是以核阳性为判定标准，根据凋亡细胞的典型表现:染色质和细胞质显著浓缩，染色质聚集呈环状或新月体状，细胞质的碎片合并有或没有染色质的浓缩，细胞内或细胞外染色质碎片. 统计学处理:随机移动组织片，选择相邻的几个视野，计数 1000 个细胞中的凋亡细胞数作为凋亡指数（AI）.采用 2 检验和 t 检验. 2 结果 2.1 HCV NS3 区抗原的分布特点和检出率 应用 HCV NS3 区抗原单克隆抗体检测
11、 LC 和 HCC 中的相应抗原发现:阳性信号见于肝细胞和癌旁肝细胞的胞质中，呈细颗粒状均匀分布，而在 HCC 细胞中少有表达.在 LC及 HCC 组织中 HCV 的 NS3 区抗原的阳性率分别为 53.6%（30 例/56 例）和39.6%（21 例/53 例）. 2.2 HCV 核心抗原的分布特点和检出率 应用 HCV 核心区抗原 2B 株单克隆抗体检测 LC 和 HCC 中的相应抗原发现:阳性信号见于肝细胞、HCC细胞的胞核或胞质中，呈细颗粒状均匀分布.在 LC 中，核心抗原以胞质阳性为主，偶见胞核阳性细胞，分布多呈灶状，汇管区小胆管上皮细胞偶可见阳性（Fig1）.在癌组织中，核心抗原以
12、弥漫或灶状核阳性分布 为多见，亦可见胞质阳性的 HCC 细胞（Fig2）.癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性，分布类似于硬化组织（Fig3）.在 LC 及 HCC 组织中 HCV核心抗原的阳性率分别为 60.7%（34 例/56 例）和 37.6%（20 例/53 例）.与NS3 区抗原相比，核心抗原在 HCC 的癌组织中阳性率显著增加（37.7%vs7.5%，P0.05） ，而在癌旁肝组织和肝硬化组织中的阳性率无显著性差异（Tab1）.2 检验表明，HCC 组织中的核心抗原的核阳性率（75.0%，15 例/20 例）明显高于其在 LC（17.7%，6 例/34 例）及癌旁肝组织（11.8%，
13、2 例/17 例）中的阳性率（P0.05）. 表 1 HCV 核心抗原和 NS3 区抗原在 LC，HCC 中表达的阳性率 略 2.3 LC 和 HCC 中凋亡细胞的特征及 AI 结果显示，阳性信号为蓝紫色颗粒，位于胞核，呈小圆形或环行.有些阳性细胞见于肝窦中，大约10m 左右的小圆形颗粒，其形态难与淋巴细胞和 Kupffer 细胞区分.在LC 中，阳性细胞在小叶内多为散在分布于小叶周边，靠近汇管区居多（Fig4）.而在癌组织中，既有散在分布的又有成簇分布的阳性细胞（Fig5）.在癌旁肝组织中阳性信号较前者少见.连续切片染色发现，在LC 中，HCV 核心抗原阳性的细胞部分发生了凋亡，并且 AI
14、明显高于 HCV阴性者（0.9730.210vs0.4390.172，P0.05）.比较 HCV 核心抗原阳性的 HCC 及其癌旁肝组织的凋亡指数，t 检验显示，HCV 核心抗原核心核转位表达的癌组织的 AI 值（0.1740.093）显著低于胞质阳性的癌组织（0.5120.113，P0.01） ，而癌旁组织的 AI 无显著差异（0.4180.191vs0.5060.113，P0.05） ，提示 HCV 核心抗原的核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡，从而促进肿瘤的进一步恶化.HCV NS3 区抗原的表达与 AI 之间未发现显著的相关性. 3 讨论 大量的流行病学研究表明，HCV 与 LC，HCC
15、 的关系非常密切，至少50%的感染者发展为慢性肝炎，约 10%20%最终发展为 LC，甚至HCC4 .应用免疫组织化学方法对 HCV 相关抗原进行检测，可为其提供直接的证据.我们用 HCV 核心抗原和 NS3 区抗原的抗体检测 HCV RNA 表达产物的分布情况，发现 HCV 感染与 LC，HCC 的发生关系密切，有较高的检出率，分别为 LC 为 60.7%和 53.6%，HCC 为 37.6%和 39.6%.结果显示，HCV 核心抗原有胞质表达阳性，也有胞核阳性，且在癌细胞中的胞核阳性率明显高于其在 LC 与癌旁组织中的核阳性率.目前逐渐有关于核心抗原核表达阳性的报道.Suzuki 等5 认
16、为 HCV 核心抗原的核表达与 HCV 核心剪切蛋白的形成有关.他提出假说即表达全长 cDNA 的 HCV 的核心蛋白（Mr2200）定位于胞质是由于在 C 末端功能域中存在锚着序列，它可使HCV 核心蛋白锚着在内质网膜上，而当 C 末端功能域受到细胞或病毒蛋白酶的编辑处理后，核心蛋白会转位到核内.并且发现 PRRGPR（3843 残基）的序列作为核定位信号起着重要的作用，这一序列在各种 HCV 株中都非常保守6 .另有研究表明 HCV 核心蛋白可能是一种基因调节蛋白5 .HCV 可能通过其表达的蛋白产物间接致癌.认为 HCV 通过表达某种调节蛋白来影响肝细胞基因组的表达调控，从而向恶性发展.
17、 图 1 图 5 略 目前，HCV 核心抗原在 HCC 细胞中的核转位表达，越来越受到国内外学者的重视，推测它可能在 HCC 的发病机制中起一定的作用.有研究表明，HCV 核心蛋白可在转录水平调节多种原癌基因及病毒基因的表达.针对HCV 核心蛋白与 Fas 系统介导的细胞凋亡的关系的研究，提示在慢性肝炎和 LC 中，HCV 核心蛋白可能在肝细胞凋亡中起着重要的促进作用7 .而最近有文献报道，HCV 核心蛋白能够抑制某些细胞发生凋亡8 ，并可与 ras 协同作用促进大鼠胚胎纤维母细胞恶性转化9 .我们的研究结果显示，在硬变肝组织中 HCV 核心蛋白的表达与肝细胞的凋亡有关.而在癌组织中出现的核心
18、蛋白的转位表达，又抑制了阳性细胞发生凋亡.HCV 核心蛋白在细胞凋亡中表现的这种不一致性使我们推测 HCV 在慢性肝炎的进展过程中为了阻碍宿主细胞的防御功能，逐渐具备了扰乱宿主细胞凋亡调控机制的能力，即由诱导转位抑制细胞发生凋亡，并促进宿主细胞的恶性转化，最终导致 HCC 的发生.因此研究 HCV 核心蛋白对多种凋亡相关基因的调控作用就显得十分重要.HCV 与细胞凋亡调控机制的研究目前尚属少见.因此，以 HCV 核心蛋白为研究的突破口，探索其在 HCV 致病和致癌机制中的确切作用，并进而为研究针对 HCC 的防止措施提供重要的理论和临床依据. 参考文献: 1Urdea MS，Wuestehub
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