1、丙型肝炎病毒核心蛋白在鼠肝中表达的诱癌作用作者：韩苏夏,李华,潘承恩,杨广笑,王全颖 【关键词】 ,丙型肝炎病毒 【Abstract】 AIM: To study the expression in rat liver and carcinogenesis of hepatitis C virus core protein. METHODS: The recombinant adenoassociated virus (rAAV) containing cDNA of HCV core protein was prepared by using recombinant virus techno
2、logy. The livers of SD bandicoots were infected by rAAV. At the 2nd month and 9th month, Southern blot assay and Dot blot assay were used to detect the integrated gene and mRNA of HCV core protein and the titer of the rAAV respectively. Carcinogenesis of hepatitis C virus core protein was tested by
3、HE staining. RESULTS: The titer of the rAAV was 2.411014 particles/L. Two and nine months after infection, all the results of Southern blot assay and Dot blot assay were positive. At the 9th month after infection, partial cells of SD bandicoots tended to be malignant. CONCLUSION: The HCV core protei
4、n expressed in the liver of SD bandicoots is involved in carcinogenesis. 【Keywords】 hepatitis C virus; viral core proteins; carcinoma, hepatocellular 【摘要】 目的： 研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)在鼠肝中的表达和可能潜在的直接致癌作用. 方法： 以病毒重组技术制备含 HCV Core 区 cDNA 的重组腺伴随病毒载体. 重组腺伴随病毒感染大鼠肝脏，感染 2, 9 mo 后分别以 Southern blot 印迹杂交法和 Dot
5、blot 杂交法检测鼠肝 HCV Core 区基因的整合、mRNA 形成情况及病毒滴度. HE 染色观察诱癌实验结果. 结果： 收获重组病毒滴度为 2.411014 颗粒数（分子数）/L. 分别感染 2, 9 mo 后检测大鼠肝脏 Southern blot 印迹杂交结果和 HCV core mRNA 均为阳性，HCV core 基因为非定点整合. 感染后 9 mo 实验组大鼠部分细胞有恶性倾向. 结论： HCV core 在大鼠肝中持续表达，初步观察到其致瘤变作用. 【关键词 】 丙型肝炎病毒；病毒核心蛋白质类；癌，肝细胞 0 引言 HCV 感染是肝细胞癌主要的病因之一，但其致癌机制仍不清楚
6、. 普遍观点认为其具有间接致癌性，我们的研究1则表明 HCV 核心（Core）蛋白可能具有潜在的直接致癌作用. 对 HCV Core 蛋白致癌作用的研究不但能揭示 HCV 的致病特征，而且对肝癌的预防和治疗具有重要意义. 1 材料和方法 11 材料 腺伴随病毒载体 pSSHG 由西安交大医学院解剖教研室惠赠，辅助质粒 pAAV/Ad 由第四军医大学病理学教研室惠赠，含 5 号腺病毒全部基因组的质粒 pFG140 由中国预防医学科学院病毒所惠赠. 重组质粒pSSHG/HCVCore 按文献1构建，人胚肾细胞株 293 细胞和大肠杆菌DH5 由本室提供，SD 大鼠,6 周龄，体质量 108130
7、g，平均(1132) g,由西安交大医学院动物中心提供. 各种工具酶购自 Promega公司. 12 方法 重组腺伴随病毒载体质粒 pSSHG/HCVCore、辅助质粒 pAAV/Ad 及质粒pFG140，磷酸钙共沉淀转染法转染 293 细胞，制备 AAV 重组病毒原液. 透析完全的重组病毒经 0.22 m 微孔滤膜除菌处理，同样以质粒 pFG140转染 293 细胞观察腺病毒毒性作用. 同时制备 pSSHG 质粒的重组腺伴随病毒作为阴性对照. 采用 Dot blot 杂交法检测重组病毒颗粒数的总量. 取 20 只 46 周龄 SD 雄性大鼠，体质量(1132) g, 切除 40%肝左叶，于肝
8、中叶深部直接注入含 HCV Core 区基因重组腺伴随病毒 20 L；另取20 只 46 周龄 SD 雄性大鼠为对照组，于肝中叶注入不含 HCV Core 区基因的重组腺伴随病毒(pSSHG). 饮水中加 600 mL/L 食用乙醇，平均每只0.2 mL/d 饮养. 重组腺伴随病毒感染鼠肝后 2 mo 及 9 mo，分别剖杀实验组、对照组大鼠，取 0.5 cm3 中叶部分肝组织，提取肝细胞基因组大分子 DNA，纯化酶切后行 Southern blot 印迹杂交.异硫氰酸胍法提取肝细胞总 RNA. HCV Core 探针行斑点杂交法检测 HCV Core mRNA.取 1.5 cm1.5 cm0
9、.5 cm 大小肝脏组织块，浸入 100 g/L 甲醛液固定过夜；流水冲洗 24 h 以减少甲醛影响；逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋；制成 0.4 cm 组织切片，行常规 HE 染色；常规脱蜡，染色，脱水，透明，封固；镜下观察肝细胞情况. 2 结果 21 重组腺伴随病毒的制备及病毒滴度制成 AAV 重组病毒原液，在72 h 内实验组细胞未见明显腺病毒毒性作用. 同时制备 pSSHG 质粒的重组腺伴随病毒作为阴性对照. 采用 Dot blot 杂交法检测受检病毒 DNA 以估计重组病毒颗粒数的总量.制备的 HCV Core cDNA 探针经地高辛标记后行斑点杂交确定标记探针浓度为 50 g/L
10、，探针标记量为 2.5 g. 以重组质粒 pSSHG/HCV Core 为测定参照物，以不同稀释度上述液体作为对照标准，检测重组病毒滴度. 与对照标准比对，重组病毒未稀释原液滴定度与标准液第 4 格（110-3）滴定度相等，可知本实验获取的重组病毒滴度为 2.411014 颗粒数（分子数）/L （Fig 1）. 22HCV Core 基因整合于宿主基因组及表达术后 2 mo 剖杀的 7 只实验组大鼠，其肝细胞 DNA 经 EcoRI 酶切的 Southern blot 杂交 NC 膜上均出现阳性显色，每个 NC 膜可出现多条显色带，不同实验鼠的杂交阳性片段分子质量并不相同，表明 HCV Cor
11、e 区基因已整合入肝细胞染色体中，且为非定点随机整合. 术后 9 mo 的实验也得到类似结果（Fig 2）. 对照组大鼠检测无阳性结果. 异硫氰酸胍法提取肝细胞总 RNA 后，以 HCV Core 探针行 Dot blot 杂交检测有无含 HCV Core mRNA 表达. 术后 2 mo实验组杂交均为阳性，显示肝细胞中有正确 mRNA 表达,术后 9 mo 的实验得到类似结果，其中以 1, 3, 5, 6, 9 号标本信号最为强烈，其余信号稍弱（Fig 3）. 对照组无阳性结果. 23HCV Core 蛋白诱发肝癌行肝叶切除术后 2 mo 观察，实验组、对照组各死亡大鼠 3 只、2 只. 分
12、别剖杀实验组 7 只、对照组 8 只大鼠，取肝中叶肝组织常规染色. 实验组大鼠肝脏可见明显中毒症状（Fig 4A）. 对照组大鼠肝脏未见明显异常. 术后 9 mo 观察 ，实验组、对照组均无大鼠死亡，剖杀各 10 只大鼠，观察肝脏变化. 实验组大鼠肝脏增大代偿，表面不平，质稍韧. 镜下观察： 肝小叶边缘纤维小梁不全分隔，肝细胞排列团块状，假小叶形成不明显，无明显中毒症状，细胞质轻度变性，细胞核增大，核仁明显，可见巨核. 4 只实验组大鼠部分细胞核轻度异型性变，表明恶性倾向（Fig 4B）. 对照组大鼠细胞轻度增大，余无明显变化. 3 讨论 HCV 体外感染尚没有理想的细胞模型，限制了 HCV
13、生物学特性、致病作用、抗病毒治疗和疫苗制备等的研究2,3;尝试将脂质体包裹的 HCV逆行胆总管直接注射入大鼠肝脏，发现肝细胞只有短暂的 HCV 基因表达. 应用转基因技术获得的带有 HCV 基因片段的转基因小鼠，对诱癌实验来说，本身可能引起的插入突变使结果可信度降低，重复性下降；转基因鼠由于在胚胎发育期就受到病毒抗原的刺激，形成免疫耐受，往往不能自发产生病症，需用同基因动物产生的病毒蛋白抗原诱导才能使模型成功，非常繁琐复杂. 目前得到确认的实验动物仍限于黑猩猩,获得可行的小动物模型是 HCV 研究的关键环节之一. 重组病毒技术进行的基因转染率高. 目前重组 AAV 遇到的主要问题是获得重组病毒
14、的低效及野毒污染问题. 实验中我们以含 5 号腺病毒全部基因组的质粒 pFG140 替代 5 号腺病毒活毒，尽量减少腺病毒的毒性作用并获得较高重组 AAV 滴度，效果良好，对照实验也无明显腺病毒毒性作用表现. 有文献报道此方法进行重组 AAV 制备液中检测不到腺病毒的污染. 研究表明 AAV 重组病毒虽可感染不分裂细胞，但对静止细胞的转导频率远远低于分裂旺盛的细胞;应用 DNA 损伤性试剂、DNA 合成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或体外 射线处理静止细胞或正常器官，可使转导频率提高数百倍. 本实验借鉴逆转录病毒转导方法，切取部分大鼠肝脏组织，刺激肝细胞进行增殖以利于提高转导效率. 由于大量实验显示
15、酒精的摄入与 HCV 的致病性可能具有相互作用4 ，故术后大鼠给予含乙醇饮水，同时设立对照组. 关于 HCV Core 蛋白的直接致癌研究已经有不少报道5,6 ，其结果并不完全一致，如 HCV Core 区与 HRas 共转染 REF 细胞使其恶性转化，Core 蛋白定位于细胞核，该实验还发现 HCV Core 蛋白可使 NIH3T3 细胞恶性转化并在裸鼠成瘤；用 HCV Core 区与 NS3 共转染 NIH3T3 细胞，也得到相同结果. 1998 年首次观察到 HCV Core 区基因转基因鼠发生肝细胞癌（HCC） ，并且其组织病理特征与 HCV 相关 HCC 形成过程极为相似. 但实验结
16、果需要进一步确认，有的实验则结论相反，无论是转基因鼠实验还是体外实验均有 HCV Core 蛋白无直接致癌性之证据7. 本实验在已成功制备出肝脏持续表达 HCV Core 蛋白的大鼠模型基础上，初步观察到其致瘤变作用，为 HCV Core 蛋白可能具有的直接致癌性提供了新的依据. 其机制可能通过 Core 蛋白的转核表达，对细胞内原癌基因转录的调节，对细胞信号传递、凋亡等的影响来实现8,9. 【参考文献】 1 李华，陈规划，潘承恩，等. 一种肝脏持续表达丙型肝炎病毒核心蛋白的小动物模型J. 中华实验外科杂志, 2003；20（3）：273-274. Li H, Chen GH, Pan CE,
17、 et al. Establishment of a small animal model expressing hepatitis C virus core protein persistently in liverJ. Chin J Exp Surg, 2003；20（3）：273-274. 2 Beard MR, Abell G, Honda M, et al. An infectious molecular clone of a Japanese genotype 1b hepatitis C virusJ. Hepatology, 1999；30（1）：316-324. 3 郑建勇,
18、李江,李开宗. 丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝(癌)细胞凋亡的关系J. 第四军医大学学报，2001;22(2):167-170. Zheng JY, Li J, Li KZ. Translocated expression of HCV core protein inhibiting apoptosis in tissues of hepatocellular carcinomaJ. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(2):167-170. 4 Hassan MM, Hwang LY, Hatten CJ, et al. Risk factors for hep
19、atocellular carcinoma: Synergism of alcohol with viral hepatitis and diabetes mellitusJ. Hepatology, 2002;36(5):1046-1049. 5 张景霞,周红超 ,德忠,等. HCV C 区基因在 SP2/0 细胞及荷瘤小鼠内的表达J. 第四军医大学学报, 2002;23(24):2236-2239. Zhang JX, Zhou HC, Xu DZ, et al. HCV core protein expression in SP2/0 cell and BALB/C mouse plas
20、macytomaJ. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(24):2236-2239. 6 Koike K, Tsutsumi T, Fujie H, et al. Molecular mechanism of viral hepatocarcinogenesisJ. Oncology, 2002;62 （Suppl 1）:29-37. 7 Koike K. HCV core gene transgenic mouse as a model for viral hepatocarcinogenesisJ. Nippon Rinsho, 2001;59(7):1265-
21、1270. 8 Kao CF, Chen SY, Chen JY, et al. Modulation of p53 transcription regulatory activity and posttranslational modification by hepatitis C virus core proteinJ. Oncogene, 2004;23(14):2472-2483. 9 Dubourdeau M, Miyamura T, Matsuura Y, et al. Infection of HepG2 cells with recombinant adenovirus encoding the HCV core protein induces p21(WAF1) downregulationeffect of transforming growth factor beta.J. J Hepatol, 2002;37(4):486-492.
