1、超氧化物歧化酶对抗肿瘤药物促宫颈癌Hela 细胞凋亡的影响【摘要】 目的 探讨超氧化物歧化酶 (SOD)对抗肿瘤药物诱导 Hela细胞凋亡的影响，并从分子生物学水平探讨 SOD作用的可能机制。方法 宫颈癌 Hela细胞经顺铂（DDP） 、足叶乙甙（VP-16）和阿霉素（ADM）血浆峰浓度不同时间作用后，测定肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平、细胞凋亡率及突变型 p53和 c-fos基因表达的变化，并测定不同时间加入 SOD对DDP、ADM、VP-16 诱导 Hela细胞凋亡及 p53、c-fos 基因表达的影响。 结果 DDP、ADM 不同作用时间对 Hela细胞 ROS产生状态和细胞凋亡的影响不
2、同， VP-16不刺激 Hela细胞产生高浓度 ROS。DDP 和 ADM作用同时加入 SOD共同孵育可降低 Hela细胞凋亡率(P0.01)，而 DDP和 ADM作用 24 h后加入 SOD对细胞凋亡影响不明显（P0.05） ，而且与 p53和c-fos基因表达变化具有一致性。结论 DDP、ADM 作用同时给予 SOD可抑制药物诱导 Hela细胞凋亡，延迟给予 SOD不影响 Hela细胞凋亡。 【关键词】 超氧化物歧化酶 宫颈癌 细胞凋亡 p53 c-fos Abstract： Objective To study on a molecular level the effects of SO
3、D on the antitumor drugs-induced apoptosis of cervical cancer cells. Methods Hela cell line was treated with 3 mgL-1 DDP, 0.4 mgL-1 ADM or 2 mgL-1 VP-16 for 6, 12, 24 and 48 h. Meanwhile or 24 h later, 316 mgL-1 SOD was added to the culture to act for 24 h, and then, the intracellular reactive oxyge
4、n species (ROS), apoptosis ratio and expressions of mutant p53 and c-fos protein of Hela cells were determined. Results The production of ROS and the apoptosis of Hella cells increased as the action of DDP and ADM continued within 24 h, but VP-16 failed to produce such effects. The apoptotic rate wa
5、s decreased when SOD was added to the culture with the drugs simultaneously, the decrement of apoptosis was very evident (P0.01), but no such effects were noticed if SOD was added 24 h later (P0.05). The expressions of p53 and c-fos in the present experiment varied similarly to the apoptosis, i.e. d
6、ecreased only when SOD was added to the culture simultaneously with the antitumor drugs. Conclusion Application of SOD at different time will have different effects on the DDP or ADM-induced apoptosis of Hella cells in vitro. Key words： superoxide dismutase; cervical cancer; apoptosis; p53; c-fos 宫颈
7、癌是妇科最常见的恶性肿瘤，严重影响广大妇女的身心健康，通常采用综合治疗。化学治疗的主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡，国外报道抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡与活性氧(ROS)产生增多有密切关系，抗癌剂可使某些肿瘤细胞株 ROS产生增多1-2 。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内最重要的抗氧剂，可用于临床肿瘤患者放化疗防护。SOD是否影响抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞凋亡目前尚未完全清楚。本研究初步探讨常用抗肿瘤药物诱导 Hela细胞凋亡与细胞内 ROS水平的关系以及 SOD对抗肿瘤药物顺铂（DDP） 、阿霉素（ADM） 、足叶乙甙（VP-16）诱导宫颈癌 Hela细胞凋亡的影响，并从分子生物学水平探讨其可能机制。
8、 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞株 Hela 细胞由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。1.1.2 抗肿瘤药 DDP（山东德州制药厂，批号：010902） ，ADM（浙江海正药业股份有限公司，批号：001204） ，VP-16（江苏恒瑞制药有限公司，批号：011211） 。 1.1.3 SOD 苏州大学核医学院江家贵教授惠赠，由猪血纯化而得，比活性为 5106 U/g，每支 3.5 mg，实验前采用黄嘌呤氧化法测定比活性。 12 方 法 12 1 Hela细胞培养 培养液为含 10%胎牛血清（FBS）(天津血液研究所)、100 Uml-1青霉素、0.1 mgml-1链霉素的
9、 RPMI-1640(GIBCO，USA)，用 100 ml培养瓶，置 5% CO2、37、饱和湿度的恒温箱中培养，细胞达 80%90%融合状态用 0.25%胰蛋白酶（上海华美生物工程公司）消化后传代。实验期间不断冻存，全部实验均用指数生长期细胞。 12.2 DDP、ADM、VP-16 处理 Hela细胞 细胞生长达 70% 融合时更换培养液同时加入药物，DDP、ADM 和 VP-16终浓度分别为 3 mgL-1、0.4 mgL-1和 2 mgL-13 ，然后继续培养，作用时间分别为12、24、48 h，每组 6瓶，重复实验 3次。 12.3 SOD处理 Hela细胞 将指数生长期的细胞分为
10、4组，对照组：更换培养液继续培养 48 h；SOD 组：在培养液中加入终浓度为 316 mgL-1 SOD；单纯药物组： 3 mgL-1 DDP、0.4 mgL-1 ADM；药物+SOD组：加入 DDP或 ADM同时或加入 24 h后再加入终浓度为 316 mgL-1 SOD，继续培养 24 h。 12.4 流式细胞仪（flow cytometry, FCM）测定 Hela细胞凋亡 收集上述不同药物、不同作用时间处理后的包括贴壁和悬浮的 Hela细胞。以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准，根据测定的 DNA组方图，用 CELLQUEST分析软件分析 Hela细胞的凋亡指数（apoptosi
11、s index，AI）和细胞增殖指数（proliferation index, PI） 。 12.5 化学比色法测定 Hela细胞 ROS产生状态 收集上述各组的Hela细胞在冰水中用电动匀浆器低速匀浆使细胞破碎，离心后取适量上清液进行 ROS测定。试剂配制及测定严格按 ROS试剂盒说明书进行，现用现配。 12.6 SP免疫组织化学染色方法检测 Hela细胞 p53、c-fos 基因产物表达 p53、c-fos 表达均定位于细胞核，棕黄、黄褐色为阳性表达，结果应用 LEICA QWIN计算机图像分析仪比较各组染色强度差异。 1.3 统计学处理 数据采用 xs表示，组间显著性差异采用 t检验。
12、2 结 果 2.1 药物不同作用时间对 Hela细胞 ROS产生状态和细胞凋亡的影响 2.1.1 DDP、ADM 不同作用时间对 Hela细胞 ROS产生状态及细胞凋亡的影响 终浓度为血浆峰浓度的 DDP、ADM 处理 Hela细胞，随作用时间延长细胞凋亡增多，ROS 水平升高,而且于 24 h达高峰浓度，与对照组比较差异显著（P0.01） ，24 h后细胞凋亡率继续上升，但细胞 ROS水平升高不明显，见表 1。 2.1.2 VP-16不同作用时间对 Hela细胞 ROS产生状态和细胞凋亡的影响 VP-16作用于 Hela细胞，随作用时间延长细胞凋亡率逐渐升高，但细胞内 ROS水平无明显变化，
13、与对照组比较无显著差异（P0.05） ，结果见表 1。表 1 DDP、ADM、VP-16 对 Hela细胞 ROS和凋亡的影响 2.2 SOD对培养 Hela细胞增殖和凋亡的影响 对照组 PI为32.545.38,AI为 0.870.06;而 SOD组的 PI为 18.263.17，AI 为1.040.13；2 组间 PI差异显著（P0.01）,而 AI差异不显著（P0.05） 。 2.3 SOD对 DDP、ADM 诱导 Hela细胞凋亡的影响 2.3.1 SOD对 DDP、ADM 诱导 Hela细胞凋亡的影响 与单纯用药组相比，同时加 DDP和 SOD组 Hela细胞凋亡率明显降低，2 组间
14、差异显著（P0.01） ，而 DDP作用 24 h后加 SOD组即 SOD（24 h）组 Hela细胞凋亡率并不降低，2 组间差异不显著（P0.05） ，结果见表 2。 2.3.2 SOD对 DDP、ADM 处理 Hela细胞 p53、c-fos 基因产物表达的影响 与单纯化疗组相比，同时加入 SOD组 p53、c-fos 光密度明显升高（P0.05） ，而 DDP、ADM 处理 Hela细胞 24 h加入 SOD组 p53、c-fos蛋白光密度无明显变化（P0.05） ，见表 2。表 2 SODD对 DDP、ADM诱导 Hela细胞凋亡及 p53、c-fos 表达的影响与单纯药物组比较：*P
15、0.05，*P0.01 3 讨 论 3.1 ROS与抗肿瘤药物诱导宫颈癌 Hela细胞凋亡的关系 目前研究认为巨噬细胞以外的细胞也可产生 ROS4 ，当细胞受到物理、化学及生物因素等刺激时，通过细胞生物膜上的 NADPH氧化酶系统的作用产生大量的 ROS，过量的 ROS引起 DNA损伤、脂质过氧化而触发凋亡5 。本组结果显示,血浆峰浓度的 DDP和 ADM作用于 Hela细胞，随着 DDP、ADM 作用时间的延长，Hela 细胞凋亡率逐渐升高，ROS 产生增多。表明DDP、ADM 均可通过激发 Hela细胞产生 ROS诱导其凋亡，在一定作用时间内 ROS水平与细胞凋亡率有密切关系。而 VP-1
16、6在血浆峰浓度作用于Hela细胞后，其诱导细胞凋亡的作用也存在时间依赖性，但 Hela细胞产生 ROS状态并无明显改变，表明 VP-16可能并不通过激发 Hela细胞产生ROS来诱导细胞凋亡。至于提高 VP-16作用浓度是否可刺激 Hela细胞产生高浓度的 ROS有待进一步研究。 抗肿瘤药物如何通过 ROS介导细胞凋亡可能因药物种类不同而不同，可通过以下多条途径促进细胞凋亡:ROS 可直接作用于细胞 DNA使之受损或断裂；ROS 诱导生物大分子发生氧化反应引起结构及构象改变, 通过氧化修饰发挥调控信号转导和对应激作出反应的功能，包括凋亡相关蛋白质的氧化、膜磷脂的氧化修饰；调节细胞相关基因表达而
17、诱导凋亡，如：p53、bcl-2、c-fos 等6-7 ；作为第二信使的 ROS的信号传导途径具有细胞种类和刺激因子特异性，不同的细胞生理调节过程所激动的 ROS相关的信号分子也不同。由于实验条件的限制，在本研究中仅利用分光光度仪通过化学比色法测定细胞内OH 水平来间接反映 O-2和H2O2的水平，未能直接测定 Hela细胞内自由基绝对水平，所以抗肿瘤药物刺激 Hela细胞产生何种 ROS及引起细胞凋亡的绝对 ROS水平，这都将是以后继续研究的内容。 3.2 SOD对抗肿瘤药物诱导 Hela细胞凋亡的影响 在生物界为了避免氧化还原状态失衡及 DNA损伤，酶类或非酶类的抗氧化系统广泛存在，主要的
18、抗氧化酶包括：SOD、过氧化氢酶（CAT） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等。SOD 是机体内最重要的抗氧化剂，它能高效率清除超氧自由基（O-2） ，从而降低由 O-2派生出的对细胞损伤更严重的活性产物，如：H2O2、.OH、ROOH 等，所以 SOD通常被称为一线抗氧化剂。研究表明应用 SOD化合物可抑制离体培养肝癌细胞增殖,并诱导细胞内 DNA断裂，具有明显的细胞毒性作用8 。本实验中，在培养液中加入 SOD后继续培养 Hela细胞，结果显示 SOD 可抑制 Hela细胞增殖，但不促进凋亡，其可能的原因：SOD 用量不足或作用时间不够；SOD 仅产生细胞增殖抑制作用；PI 法测定对早
19、期凋亡细胞不敏感。遗憾的是由于各种原因本实验未采用其他实验方法测定早期凋亡细胞，这将有待于今后进一步研究。 本组结果显示，当向培养基中加入 DDP或 ADM同时加入 SOD共同孵育，Hela 细胞凋亡明显减少；表明 SOD与 DDP、ADM 同时处理体外培养Hela细胞可影响抗肿瘤药物的作用，SOD 通过迅速清除 O-2使 Hela细胞不能产生更高浓度的 ROS诱导细胞凋亡。而在 DDP或 ADM处理 Hela细胞24 h后再加入 SOD，细胞凋亡并不减少，表明 DDP或 ADM已经刺激 Hela细胞产生介导细胞凋亡的信使 ROS，再加入 SOD后并不影响 Hela细胞凋亡，这也进一步证明了
20、DDP、ADM 诱导 Hela细胞凋亡与细胞内 ROS水平增高有关，也将为抗氧化剂在临床防治化疗副损伤方面的广泛应用提供理论依据。 3.3 ROS及 SOD对 Hela细胞基因表达的影响 免疫组化结果表明抗肿瘤药物 DDP、ADM 处理 Hela细胞可产生更高浓度 ROS 下调突变型 p53基因和 c-fos基因的表达，同时加入 SOD共同作用时 Hela细胞 p53和 c-fos蛋白表达增高，而在 24 h后加入 SOD则无明显变化，这与 Hela细胞凋亡变化一致。p53 基因是公认的肿瘤抑制基因，大约一半以上的肿瘤细胞中 p53发生突变或丢失。p53 与细胞凋亡密切相关，其对细胞凋亡的调控
21、是通过抑制细胞的生长来进行的，而 ROS可通过影响细胞内大分子的氧化还原状态来调节 p53基因 。此外，肿瘤抑制因子 P53蛋白对锰超氧化物歧化酶（MnSOD）有负调控作用，MnSOD 基因有可能是 P53蛋白的作用靶位点，而 MnSOD基因已经被认为是一种新型的肿瘤抑制因子9 。ROS还可引起正常细胞恶性转化过程中细胞的一些癌基因如 c-jun和 c-fos表达增高，另外野生型 p53可抑制 c-fos基因的转录。因此认为DDP、ADM 诱导 Hela细胞凋亡很重要的一方面是通过 ROS调节 p53和 c-fos基因表达水平来实现的。 总之，多数抗肿瘤药物可通过刺激细胞产生 ROS 诱导宫颈
22、癌 Hela细胞凋亡，不同时间应用 SOD对药物诱导 Hela细胞凋亡的影响不同，延迟应用可明显减轻 SOD对细胞凋亡的抑制作用，提示我们临床上应用 SOD保护机体的化疗损伤应注意使用时间以防影响化疗效果。体外实验的结果可能与机体内结果不完全相同，但可为进一步实验提供理论基础。 【参考文献】 1 Sinha BK, Mimnaugh EG, Rajagopalan S, et al. Adriamycin activation and oxygen free radical formation in human breast tumor cells: prospective role of g
23、lutathione peroxidase in adriamycin resistanceJ. Cancer Res,1989,49（4）:3844-3848 2 Masuda H, Tanaka T, Tateishi M, et al. Detection and cytotoxicity of cisplatin induced superoxide anion in monolayer cultures of a human ovarian cancer cell lineJ. Cancer Chemo Pharmacol,2001,47（2）:155-160 3 Sondak VK
24、, Bertelsen CA, Kern DH, et al. Evaluation and clinical application of a rapid chemosensitivity assayJ. Cancer, 1985,55（6）:1367-1371 4 Hunt CR, Sim JE, Sullivan SJ, et al. Genomic instability and catalase gene amplification induced by chronic exposure to oxidative stressJ. Cancer Res,1998,58（17）:398
25、6-3992 5 oo SH, Park IC, Park MJ, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis through a reactive oxygen species-dependent pathway and loss of mitochondrial membrane potential in Hela cellsJ. Int J Oncol,2002,21(1):57-63 6 Provinciali M, Donnini A, Argentati K, et al. Reactive oxygen species modulate Z
26、n2+ -induced apoptosis in cancer cellsJ. Free Radic Biol Med,2002,32(5):431-445 7 Pero RW, Anderson MW, Anna CH， et al. Oxidative stress induces DNA damage and inhibits the repair of DNA lesions induced by N-acetylaminofluorene in human peripheral mononulear leukocytesJ. Cancer Res,1990,50(15):4619-4625 8 肖 良，丁书茂，鲁志松，等.SOD 模拟化合物对离体肝癌细胞内DNA的损伤作用J.肿瘤防治杂志，2004，11（11）：1130-1132 9 Pani G, Bedogni B, Anzevino R, et al. Deregulated manganese superoxide dismutase expression and resistance to oxidative injury in p53-deficient cellsJ. Cancer Res,2000,60(14):3927-3939
