1、参附注射液对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤的治疗时间窗作者：郑 玉，熊利泽，朱正华，王 强，陈绍洋 【关键词】 参附注射液 关键词: 参附注射液;脑缺血;治疗时间窗 摘 要:目的 探讨参附注射液对局灶性脑缺血性损伤的治疗时间窗. 方法 80 只雄性 SD 大鼠，随机分为 8 组（每组 n=10）:对照组，即单纯缺血再灌注组;参附注射液治疗 AG 组，分别于缺血再灌注后0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0 和 6.0h 经腹腔注射参附注射液，剂量为10mL kg-1 .用右侧颈内动脉线栓法致大脑中动脉阻闭 120min，拔出尼龙线即刻为再灌注时间.观察再灌注后 24h 时神经功能损害改变并评分
2、，24h 时处死动物，取大脑行 TTC 染色以测量脑梗死容积. 结果 24h 时神经功能损害评分，AF 组分别为:0.50.3，0.50.4，0.60.5，0.80.4，0.80.3 和 0.90.3，明显低于对照组（2.10.8）及 G 组（1.50.7） （P0.05）.脑梗死容积 AF 组分别为（46.426.1） ， （60.225.8） ， （67.236.7） ，（76.039.7） ， （94.134.9）和（98.435.3）mm3 ;均明显小于对照组（182.639.6）mm3 及 G 组（139.142.8）mm 3 （P0.05） ，AF 组间 24h 时神经功能损害评分
3、和梗死容积无差别（P0.05）. 结论 参附注射液对局灶性脑缺血再灌注损伤的最佳治疗时机在缺血后 4h 以内. Keywords:Shenfu solution;cerebral ischemia;therapeutic time window Abstract:AIM To investigate the therapeutic time window for Shenfu solution in transient focal cerebral ischemic injury in rats.METHODS 80male SD rats weighing280350g were rando
4、mized into8groups（n=10in each group）:Con-trol group，receiving no pharmacological intervention，Groups AG，receiving intraperitoneal injection of Shenfu solution（10mL kg-1 ）at0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0and6.0h respectively after120min middle cerebral artery occlu-sion（MCAO）with3-0nylon monofilament via the r
5、ight in-ternal carotid artery.The neurological outcomes were evalu-ated24h after the reperfusion.The brain infarct volumes were then assessed by TTC staining.RESULTS The neuro-logical deficit scores（NDS）for Groups AF24h after the reperfusion were0.50.3，0.50.4，0.60.5，0.80.4，0.80.3and0.90.3，respective
6、ly，which were obviously lower than those of the control group（2.10.8 ）and Group G（1.50.7） （P0.05）.The infarct volumes of the control group（182.639.6）mm3 and Group G（139.142.8）mm3 were significantly larger than those of Groups AF（46.426.1） ， （60.225.8） ， （67.236.7） ，（76.039.7） ， （94.134.9）and（98.435.
7、3）mm3 ，respectively（P0.05）24h after the reperfusion.There were no differences between Groups AF in both NDS and infarct volume（P0.05）.CONCLUSION Therapeutic time window for Shenfu solu-tion in transient focal cerebral ischemic injury lasts for at least4h. 0 引言 急性脑缺血/再灌注损伤可引起严重的神经功能障碍，甚至危及生命.如何防治脑缺血/
8、再灌注损伤，寻找有效的治疗药物及措施，以促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复一直是相关学科研究的重点之一.近年来中药神经保护作用研究越来越受到重视.我们以前的研究发现参附注射液对兔脊髓及大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护和治疗作用1-3 ，其主要成分人参皂甙对脑缺血性损伤的保护作用亦有报道4-7 .但参附注射液对脑缺血性损伤的治疗时间窗研究尚未见报道.鉴于临床上对脑损伤的治疗基本上都是在发病后，研究参附注射液对脑损伤治疗作用时间窗具有重要意义.因此，本实验用大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO）研究参附注射液对急性脑损伤保护作用的治疗时间窗. 1 材料和方法 1.1 动物 实验动物由第四军医大学实验动物中心
9、提供.80 只雄性SD 大鼠（280350g） ，随机分为 8 组（各组 n=10）:对照组，即单纯缺血再灌注组;参附注射液治疗 AG 组，分别在缺血后0，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0 和 6.0h 经腹腔注射参附注射液，剂量为10mL kg-1 .参附注射液为深圳南方制药厂 雅安三九药业有限公司生产，批号:991202. 1.2 方法 1.2.1 局灶性脑缺血模型 动物术前禁食 12h，自由饮水.用 40mL L-1 异氟醚诱导麻醉，20mL L-1 异氟醚吸入维持麻醉深度，保留自主呼吸.术中体温由肛温探头连接多功能监测仪（Spacelab，USA）监测，并用烤灯维持在 37.03
10、7.5.MCAO 模型采用右侧颈内动脉尼龙线线栓法，应用 Koizumi 等8 的方法，动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线（3-0，ETHICON，Japan）置入颈内动脉 1718mm，直到有轻微阻力感为止9-11 .阻闭 2h 后抽出尼龙线，恢复再灌注. 1.2.2 动物恢复及神经功能损害评估 麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食.脑缺血再灌注后 1，3，6，12，16 及 24h，由一不了解分组情况的观察者评估记录神经功能损害评分，方法参考 Longa 等12 的报道，即 6
11、级评分法:0 级，无功能障碍;1 级，不能伸展左侧前肢;2 级，向左侧旋转;3 级，向左侧倾倒;4 级，无自主活动伴意识抑制;5 级，死亡. 1.2.3 脑梗死灶容积测量 24h 神经功能损害评分完成后，动物用40mL L-1 异氟醚深麻醉后被断头处死，迅速取出鼠脑，置于冰盐水中10min，取冠状面均匀切成 2mm 脑厚片，迅速放入 20g L-1 TTC 溶液（37）中染色 30min，然后用 40g L-1 甲醛液固定.24h 后将脑片用数码相机（Kodak，DC240，USA）拍照，输入计算机，用图像处理软件（Adobe，Photoshop5.0）计算梗死面积（粉红色区为正常脑组织，白色
12、区为梗死区） ，各脑片梗死面积之和乘以厚度（2mm）为总的梗死容积. 统计学处理:数值用 x s 表示.梗死容积用单因素方差分析方法（ANOVA）统计.神经功能损害评分用 Kruskal-Wallis 方法检验.P0.05 表示统计 学差异明显. 2 结果 2.1 神经行为学改变 术后动物有 4 只死亡，经解剖发现为蛛网膜下腔出血致死，这些动物不计算在统计结果中.其余动物均存活.再灌注24h 之内动物均表现一定神经功能障碍，但 AF 组较对照组轻，24h 后对照组及 G 组神经功能障碍加重，AF 组呈减轻趋势;24h 神经功能损害评分对照组及 G 组与 AF 组间差异明显（P0.05） ，AF
13、 组间神经功能损害评分无差异（P0.05） （Fig1）. 图 1 略 2.2 脑梗死容积 再灌注 24h 脑梗死容积，对照组为（182.639.6）mm3 ，AG 组分别为（46.426.1） ， （60.225.8） ，（67.236.7） ， （76.039.7） ， （94.134.9） ， （98.435.3）和（139.142.8）mm3 ，AF 组梗死容积均明显小于对照组及 G 组（P0.01，P0.05） ，AF 组间梗死容积无明显差异（P0.05，Fig2）. 图 2 略 3 讨论 我们利用大鼠 MCAO 模型对参附注射液的神经保护作用治疗时间窗进行了研究，并证实其在大鼠短暂
14、性局灶性脑缺血损伤后至少 4h 内具有比较显著的治疗作用;而在 6h 后则没有明显的治疗作用.研究表明，神经保护药物及方法具有一定的治疗时间窗13-16 .Zhang 等17 报道抗CD-11b 和抗 CD-18mAb 于缺血 4h 内对大鼠脑损伤有保护作用;Markarian等18 报道浅低温（3233）对大鼠脑缺血损伤在 3h 内有明确的保护作用;Markgraf 等19 报道 Calpain 抑制剂对大鼠的神经保护作用治疗时间窗是 6h.另外，有报道证实重组组织血浆酶原激活物（rt-PA）在 3h 内对中风患者具有较为满意的治疗作用20，21 .参附注射液的神经保护作用已得到证实1-3
15、，其治疗时间窗报道甚少.本实验在大鼠 MCAO 模型中证实，其对短暂性 MCAO 所致局灶性脑损伤的治疗时间窗为缺血损伤后 4h 内，与其他神经保护剂类似. 研究发现，脑缺血损伤包括病灶中心的坏死灶及其周围的缺血半暗区（penumbra）.缺血半暗区的结局通常有两个:一是经有效的治疗使其转为正常，二是继续恶化最终成为坏死灶16，22 .从治疗角度讲，目前所有措施均是针对缺血半暗区.如果未给予任何治疗措施，脑缺血损伤后的半暗区继续恶化最终导致坏死的自然过程通常为 36h，此时间被认为是治疗时间窗.任何的治疗必须在此时间内开始，许多研究从机制上研究此时间窗的原因，可能与缺血半暗区神经细胞早期的甘油
16、磷脂破坏等能量代谢障碍及凋亡有关17，19，22，23 ，这至少部分地解释了大部分神经保护药物的治疗时间窗在 36h 内的原因，包括本实验对参附注射液的研究结果.本实验继续研究参附注射液的机制提供了线索.参附注射液主要成分为人参皂甙和乌头碱，分别为红参和黑附片的提取物.研究报道，参附注射液对脑、心肌、肾缺血再灌注损伤、内毒素休克肺损伤具有一定的保护作用24，25 .近年来研究发现，人参皂甙对脑缺血损伤有显著的保护作用4-7 .但研究发现参附注射液的脑保护及治疗作用并无明显的剂量-效应关系1-3，5-7 .因此，本实验选用了 10mL kg-1 这一剂量进行研究，证实了参附注射液在大鼠局灶性脑损
17、伤后 4h 内的治疗时间窗.本实验结果的临床意义在于:对脑中风等脑血管疾病患者，早期（4h 内）使用参附注射液有利于患者的神经功能恢复，尤其可减轻脑缺血损伤所致的神经功能障碍;但若在缺血发生 6h 后应用此药，其效果 可能减弱.由于参附注射液具有毒副作用小，临床应用剂量安全范围宽等优点，我们认为在临床上适时应用此药有一定的价值. 参考文献: 1Zhu ZH，Xiong LZ，Dong HL，Hu WN，Chen SY，Wang Q.Study on the protective effect of Shenfu injection against is-chemic spinal cord i
18、njury in rabbits J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3）:278-282. 2Zhu ZH，Xiong LZ，Dong HL，Hu WN，Cheng SY.Dose re-sponse effects of Shenfu injection on ischemic reperfusion injury of spinal cord in rabbits J.Zhonghua MazuixueZazhi（Chin J Anesthesiol） ，2000;21（11）:664-668. 3Zhu
19、ZH，Xiong LZ，Dong HL.The neuroprotection of Shenfu solution in transient focal cerebral ischemic injury in rats J.Zhongguo Zhongxiyi JiheJijiu Zazhi（Chin J Integnated Tradit Western Med Intensive Crit Care） ，2001;8（2）:79-81. 4Chen JF，Liu M，Chen SW.The changes of Ach and ChAT in acute cerebral ischemi
20、c tissue and the influence of ginsenosides on it J.Zhongfeng Yu Shenjing Jibing Zazhi（Apoplexy and Nervous Dis） ，1998;15（3）:157-158. 5Zhang YG，Liu TP.Influence of ginsenosides Rb1and Rg1on reversible focal brain ischemia in rats J.Acta Pharmacol Sin，1996;17:44-48. 6Lim JH，Wen TC，Matsuda S，Tanaka J，M
21、aeda N，Peng H，Aburaya J，Ishihara K，Sakanaka M.Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rb1，a main ingredient of ginseng root J.Neurosci Res，1997;28:191-200. 7Zhong G，Jiang Y.Calcium channel blockade and anti-free-radi-cal actions of ginsenoside J.Chin Med J Engl，1997;110:28-29. 8Koi
22、zumi T，Yoshida Y，Nakazawa T.Experimental studies of ischemic brain edema:A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area J.Jpn J Stroke，1986;8:1-8. 9Xiong LZ，Zhu ZH，Dong HL，Hou LC，Chen SY.Hyperbaric oxygen preconditioning induces ne
23、uroprotection against ischemia transient not permanent MCAO rat model J.Chin Med J，2000;113:836-839. 10Xiong LZ，Zhu ZH，Dong HL，Hou LC，Chen SY.Isoflurane preconditioning induces ischemic tolerance in MACO rats J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（5）:474-476. 11Wang Q，Xiong LZ，Ch
24、en SY， Sang HF，Zhu ZH，Dong H.Dose-dependent therapeutic effects of tetramethylpyrazine on spinal cord injury in rabbits J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;（12）:1098-1103. 12Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，Cummins R.Reversible middle cerebral artery occlusion artery occlusion wit
25、hout craniectomy in rats J.Stroke，1989;20:84-91. 13del Zoppo GJ，Wagner S，Tagaya M.Trends and future devel-opments in the pharmacological treatment of acute ischaemic stroke J.Drugs，1997;54:9-38. 14Zivin JA.Facts determining the therapeutic window for stroke J.Neurology，1998;50:599-603. 15Dyker AG，Le
26、es KR.Duration of neuroprotective treatment for ischemic stroke J.Stroke，1998;29:535-542. 16Fisher M，Takano K.The penumbra，therapeutic time window and acute ischaemic stroke J.Baillieres Clin Neurol，1995;4:279-295. 17Zhang ZG，Chopp M，Tang WX，Jiang N，Zhang RL.Postis-chemic treatment（2-4h）with anti-CD11b and anti-CD18mon-oclonal antibodies are neuroprotective after transient（2h）
