1、大肠腺癌中基质金属蛋白酶2 、9 及其抑制剂1 、2 的表达作者：陈谦，柯娟，王纪全，邓怀慈【摘要】 目的 探讨人大肠腺癌组织中基质金属蛋白酶2 、9(MMP2 、9) 及其抑制剂1 、2(TIMP1 、2) 的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学 SP 法检测 MMP2 、MMP9 和TIMP1 、TIMP2 在 30 例大肠腺癌组织及相应切缘正常组织中的蛋白表达。结果 大肠腺癌组织中 MMP2 、MMP9 及 TIMP1 的阳性表达明显高于正常切缘组织(P0.05)，并与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期以及淋巴结转移呈正相关(P0.05);TIMP2 在大肠腺癌组织中低表达(P0
2、.05)，并与浸润深度、Dukes 分期以及淋巴结转移呈负相关(P0.05)，与肿瘤分化程度无明显相关性(P0.05);MMP9 和TIMP1 表达明显相关(r=0.4924, P0.05)。结论 MMP2 、MMP9及 TIMP1 的过度表达与大肠腺癌的侵袭、转移有密切关系，其联合检测有助于评估大肠腺癌的恶性生物学行为及预后。 【关键词】 大肠癌;基质金属蛋白酶;组织金属蛋白酶抑制剂;免疫组织化学ABSTRACT: Objective To study the expressions of matrix metalloproteinase2 (MMP2), matrix metallopro
3、teinase9 (MMP9) and their inhibitors, tissue inhibitor of metalloproteinase TIMP1 and TIMP2, in human colorectal cancer and their clinical significance. Methods The expressions of MMP2, MMP9, TIMP1 and TIMP2 in 30 primary colorectal tumors and adjacent noncancerous tissues were detected by immunohis
4、tochemical SP method. Results The positive rates of MMP2, MMP9 and TIMP1 in colorectal cancer were significantly higher than those in adjacent noncancerous tissues (P0.05), and were closely associated with tumor differentiation, Dukes stages, progression of invasion depth and lymph node metastasis (
5、P0.05). The positive rate of TIMP2 was much lower in colorectal tissues than in adjacent noncancerous tissues (P0.05), and was negatively correlated with Dukes stages, progression of invasion depth and lymph node metastasis (P0.05), but not to tumor differentiation (P0.05). A close correlation was p
6、resent between MMP9 and TIMP1 expression (r=0.4924, P0.05). Conclusion Overexpressions of MMP2, MMP9 and TIMP1 are obviously correlated with both invasion and metastasis of colorectal cancer, combined detection of which may be helpful in determining the biological behavior and prognosis of colorecta
7、l cancer.KEY WORDS: colorectal cancer; matrix metalloproteinase; tissue inhibitor of metalloproteinase; immunohistochemistry组织的浸润与转移是恶性肿瘤细胞的基本生物学特征之一1，有 80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制剂组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)共同维持细胞迁移和细胞外基质重建的动态平衡，其平
8、衡失控是导致肿瘤细胞侵袭、转移的关键性事件2。本研究采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(streptavidinperioxidase, SP)法检测 MMPs 和 TIMPs 在大肠腺癌组织及癌旁正常组织中的表达,探讨其在大肠癌的发生、发展、侵袭和转移中的作用,以期为评估预后和治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 标本来源 标本选自西安交通大学医学院第一附属医院 2007年 9 月2007 年 12 月间手术切除后经病理证实的 30 例原发性大肠腺癌患者。其中男性 20 例，女性 10 例;年龄 3380 岁，平均 54.3 岁;结肠癌 20 例，直肠癌 10 例;高 中分化癌 26 例，低
9、 未分化癌 4 例;有淋巴结转移者 16 例，无淋巴结转移者 14 例。Dukes 分期：A 期+B 期 14 例，C 期+D 期 16 例。同时取正常结、直肠组织 30 例(正常手术切缘组织，正常切缘距肿瘤边缘至少 10cm)进行染色对照。1.2 主要试剂 兔 MMP2 、MMP9 、TIMP1 、TIMP2 抗人多克隆抗体及通用型 SP 免疫组化试剂盒、DAB 试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3 方法 采用免疫组化 SP 法。用已知阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照,用 PBS 代替一抗作为阴性对照。1.4 结果判断 MMP2 、MMP9 、TIMP1 及 TIMP2 的阳性显色
10、均为细胞质出现棕黄色颗粒。根据阳性目标积分吸光度值，将免疫组化染色程度分为，(-)：吸光度值5;(+)：5吸光度值10;() ：10吸光度值15;() ：吸光度值15。(-)为阴性表达;(+/) 为弱阳性表达;() 为强阳性表达。1.5 统计学分析 应用 SPSS11.5 统计软件进行 2 检验、Fisher确切概率法检验及 Spearman 等级相关分析。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 MMP2 、MMP9 、TIMP1 、TIMP2 在大肠腺癌组织和正常切缘组织中的表达 MMP2 、MMP9 、TIMP1 、TIMP2 阳性染色为细胞质和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒,主
11、要表达于肿瘤细胞和(或)瘤旁的正常间质(图 1、图 2)。大肠癌组织中 MMP2 、MMP9 、TIMP1 表达的阳性率分别为 100%(30/30)、100%(30/30)、73.3%(22/30)，明显高于癌旁正常组织的 73.3%(22/30)、76.7%(23/30)、40%(12/30)，差异有统计学意义(P0.05);并且 MMP2 和 MMP9 阳性表达的增强较 TIMP1 更明显。TIMP2 在肿瘤组织中的阳性表达率为 46.7%(14/30)，显著低于正常切缘组织中的 80%(24/30)，经 2 检验差异有统计学意义(P0.05)。2.2 MMP2 、MMP9 、TIMP1
12、 、TIMP2 的表达与临床病理特征的关系 TIMP1 、MMP2 、MMP9 表达强度与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes 分期以及淋巴结转移呈正相关(P0.05);与之相反的是 TIMP2在大肠癌组织中低表达，并且随着浸润深度加深、Dukes 分期越晚以及伴有淋巴结转移，其阳性表达率越低(P0.05)，但与肿瘤分化程度无明显相关性(P0.05，表 1)。2.3 MMP2 、MMP9 、TIMP1 、TIMP2 表达的相互关系 Spearman 等级相关分析表明，TIMP1 与 MMP9 表达存在正相关性(r=0.4924，P0.05)，其余指标表达之间均无明显相关性(表 2)。3 讨 论M
13、MPs 是一类具有 Zn2+依赖性的高度保守的内源性蛋白水解酶，几乎能降解除多糖外的细胞外基质的所有成分。TIMPs 则是一组内在特异性抑制 MMPs 活性的多功能因子。TIMPs 与 MMPs 之间相互作用决定着细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)稳态的平衡,影响着肿瘤细胞的迁移和黏附，在组织浸润与转移中具有重要的意义3。表 1 MMP2,MMP9,TIMP1,TIMP2 的表达与大肠腺癌临床病理的关系Tab.1 Relationship between clinicopathological characters and expression of MMP2/MM
14、P9 and TIMP1/TIMP2 in colorectal cancerFactorMMP2+/P4MMP9+/P6TIMP1-+/P8TIMP2-+PDifferentiation Wellmoderately differentiated2060.051880.0581440.0514120.05 Lowlypoorly differentiated040400422Depth of invasion Muscular layer400.05400.052200.05040.05 Serous layer1610141261281610Lymph node metastasis Po
15、sitive880.054120.054480.051420.05 Negative1221404100212Dukes stage A+B1220.051400.0541000.052120.05 C+D88412448142 表 2 MMP2,MMP9,TIMP1,TIMP2 表达之间的相互关系目前认为肿瘤侵袭和转移起始于 MMPs 降解，破坏肿瘤组织周围的ECM 和基底膜;随后，瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织迁移、黏附。型胶原和层黏连蛋白等是构成 ECM 和基底膜的主要结构蛋白，而 MMPs之一的明胶酶(MMP2 、MMP9) 则是降解型胶原三螺旋结构的主要酶系,因而在肿瘤的侵袭转移中
16、有重要起始意义45 。临床研究亦表明，MMP2 、MMP9 以及特异抑制蛋白 TIMP2 、TIMP1 表达异常多与肿瘤进展密切相关67 。本研究结果表明，大肠腺癌组织中 MMP2 、MMP9 的表达阳性率(100%)明显高于正常切缘组织(P0.05)，提示 MMP2 、MMP9 在肿瘤原位生长中的促进作用。本组结果与同类文献相比较高8，可能与实验例数较少以及实验方法差异有关。MMP2 、MMP9 的阳性表达强度与大肠癌的分化及局部浸润程度、淋巴结转移与否以及 Dukes 分期呈正相关(P0.05)，这些特征表现与 MMP2 、MMP9 对于肿瘤侵袭激励机制密切相关9。本组结果提示我们，MMP
17、2 、MMP9 表达增强提高了大肠癌的侵袭、转移能力以及随之而来的不良预后。在实验中我们也观察到 MMP9 表达较强的部位位于癌巢的周边区域及侵袭最活跃的位置，这与 BODEY 等10观察到的结果相同。提示 MMP9 在肿瘤侵袭方向上表达较高，应考虑为肿瘤细胞侵袭转移的正性调控因素。TIMPs 是 MMPs 的特异性天然抑制剂，这其中 TIMP1 主要结合抑制活化的 MMP9 和 MMP3;TIMP2 则与活化的或无活性的 MMP2 结合，终止 MMP2 的活性。本组实验中 TIMP1 在大肠腺癌组织中有较高表达，其与浸润深度、Dukes 分期、病理分级以及淋巴结转移呈正相关，且差异有统计学意
18、义(P0.05)。这与 ISHIDA 等11研究结果近似。也有研究认为TIMP1 mRNA 水平可作为结直肠癌患者预后的指标12。提示 TIMP1表达的增高预示着肿瘤更具侵袭力以及更差的预后。TIMP1 的高表达可能反映了宿主控制 MMPs 活性提高的反馈性调节，其目的保护 ECM 完整性以对抗肿瘤的侵袭;但其升高程度小于 MMPs 的升高程度，使得 MMPs 的活性无法完全被 TIMP1 所抑制，两者失平衡以致肿瘤侵袭和转移的发生。CURRAN 等13认为 TIMPs 与 MMPs 之间的平衡与细胞外基质降解的关系可能更为密切。我们的实验也观察到 TIMP1(73.3%) 和 MMP9(10
19、0%) 在大肠腺癌组织中不均衡的表达，且两者的表达具有相关性(r=0.4924，P0.05)，MMP9 阳性表达增强较 TIMP1 更明显。也有研究表明 TIMP1 是血清生长因子活性的重要组成成分，在肿瘤早期其蛋白表达增高并具有刺激肿瘤生长的作用，而在肿瘤晚期阶段则起到抑制作用14。这可能也是 TIMP1 表达增高的原因之一，提示 TIMP1在肿瘤调控中的复杂性。TIMP2 是体内 MMP2 的特异性高效抑制剂，在肿瘤的侵袭和转移过程中起抗侵袭和抗转移作用15。本组实验中 TIMP2 在癌组织中的表达明显低于正常切缘组织，且与浸润深度、Dukes 分期以及淋巴结转移呈负相关(P0.05);但
20、与组织分化程度无关联(P0.05)。提示在大肠腺癌中 MMP2 与 TIMP2 间表达失衡致使 ECM 的降解，是启动肿瘤细胞迁移及黏附等恶性行为的关键因素之一。大肠腺癌晚期 TIMP2 表达也可能升高，这与 ECM 降解加速、MMP2 活化增强导致其反应性的提升相关。这种 TIMP2 表达的升高可能预示着一种不良预后16。TIMP2 阳性表达高低与预后和侵袭能力的关系仍需更多文献研究。综上所述，本研究结果表明 MMP2 、MMP9 、TIMP1 的过度表达与大肠腺癌的侵袭、转移以及临床病理进展有密切关系，其联合检测有助于评估大肠腺癌的恶性生物学行为及预后。TIMP1 、2 与MMP9 、2
21、间表达失衡是大肠腺癌侵袭、转移的始动原因之一，选择性地提高 TIMPs 表达可作为 MMPs 生物治疗之新的靶点，值得更深入地研究。【参考文献】1HANAHAN D, WEINBERG RA. The hallmarks of cancer J. Cell, 2000, 100(1):5770.2YOON SO, PARK SJ, YUN CH, et al. Roles of matrix metalloproteinases in tumor metastasis and angiogenesis J. J Biochem Mol Biol, 2003, 36(1):128137.3DER
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