1、大鼠局灶脑缺血基质金属蛋白酶 2 的表达作者：张树平 王桂花 王垣芳 姜文国 栾海云 【摘要】 目的 研究大鼠局灶脑缺血后基质金属蛋白酶2 （Matrix metalloproteinase2, MMP2 ）在不同时相的表达，探讨 MMP2 与缺血性损伤的关系。方法 制作大鼠自体血栓性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在不同时点用免疫组化染色观察 MMP2 表达情况，并与假手术组进行对照。结果 缺血 6 h 后 MMP2 表达很少，24 h 表达上调，5 d 达最高水平。MMP2 主要表达在星形细胞、巨噬细胞。结论 缺血后出现 MMP2表达的上调，影响缺血性卒中的转归。 【关键词】 大脑中动脉闭
2、塞；免疫组化；缺血性脑损伤 【Abstract】 Objective To explore the induction of matrix metalloproteinase2 expression at different time after transient focal cerebral ischemia in order to understand the relation between MMP2 and tissue injury in ischemic brain. Methods Rats were subjected to embolic focal ischemia by
3、 placing homologous blood clots into the middle cerebral artery The expression of matrix metalloproteinase2 of all the groups was analysed by immunohistochemistry at 6 h,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d after ischemia and compared with sham operation.Results The expression of MMP2 at 6 h after ischemia was very
4、limited, then significant upregulation at 24h. MMP2 activity reached maximum levels by 5d.The expression of MMP2 was detected in astrocytes and macrophages.Conclusion The study indicated that MMP2 was upregulated，which possibly had affection to the development of stroke. 【Key words】 cerebral ischemi
5、a,matrix metalloproteinases,immunohistochemistry 缺血性脑损伤的原因之一是局部发生炎症反应，最早是白细胞粘附内皮细胞，继而血脑屏障遭破坏，炎性细胞侵入缺血受伤脑组织。血脑屏障对维持神经组织内环境的相对稳定十分重要，研究发现脑缺血及再灌后出现 MMPs 的表达增加，尤其是 MMP2 和 MMP9 活性增加，与脑微血管通透性、血脑屏障(BBB)通透性、BBB 的崩溃、炎性细胞侵入和脑水肿明显相关。使用合成的 MMPs 抑制剂可以不同程度地抑制以上改变。故本研究以大鼠为对象，研究短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的局灶脑缺血后 MMP2 不同时相的表达
6、，探讨 MMP2 在局灶性脑缺血中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 由山东医科大学新药评价中心动物部提供的Wistar 雄性大鼠 42 只, 鼠龄 2 个月左右,体重 300400 g,随机分为 7 组，每组各 6 只：假手术组；缺血 6 h 组；缺血 1 d 组；缺血 2 d组；缺血 3 d 组；缺血 4 d 组；缺血 5 d 组。 1.2 主要试剂来源 MMP2 单克隆抗体，内源性过氧化物酶阻断剂，生物素标记二抗工作液，辣根酶标记链霉卵白素工作液，正常山羊血清,DAB 显色试剂盒，多聚赖氨酸防脱片剂，抗体稀释液, OTC（冰冻切片包埋剂） ，以上试剂均来自北京中山生物技术有
7、限公司。 1.3 大鼠自体血栓 MCAO 的制作 采用毛春等在 Busch 法1基础上引进和改良的方法2制作大鼠自体血栓 MCAO 模型。 1.4 假手术组的制作 将大鼠用 10%水合氯醛麻醉，于颈正中切开皮肤后，逐层分离以暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉和翼腭突动脉，将颈外动脉远心端结扎，结扎翼腭突动脉，颈总动脉和颈内动脉处打活结结扎。然后将颈外动脉远心端剪一“”型小口，将含磷酸缓冲液的麻醉导管末端从切口处由颈外动脉远心端向近心端方向逆向穿刺至颈总动脉分叉处。固定麻醉导管，松开颈内动脉处活结，缓缓将导管内磷酸缓冲液注入颈内动脉，结扎颈外动脉近心端，松开颈总动脉活结，逐层缝合浅筋膜和皮肤。
8、 1.5 标本取材 每组动物分别用 10%的水合氯醛麻醉后，立即暴露心脏，经左心室快速灌注 PBS（4）40 ml 后再灌注 4%的多聚甲醛（4）40 ml, 快速断头取脑后浸入 4%的多聚甲醛（ 4）24 h，最后保存在4的磷酸缓冲液中 20%的蔗糖溶液中。 1.6 免疫组织化学方法 冰冻切片室温放置 30 min 后，PBS 洗 3 次，3%过氧化氢孵育，正常山羊血清工作液封闭，滴加 120 的 MMP2 单抗孵育过夜，然后逐次滴加生物素标记二抗工作液和辣根酶标记的链霉卵白素工作液，DAB 显色，脱水，透明封片。 2 结果 MMP2 阳性表达细胞数与对照组比较在缺血 6 h 没有明显差别，
9、在缺血 24 h 有所增加，到缺血 5 d 达到最高峰，主要表达在星形细胞、巨噬细胞，免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染颗粒（如图 1 所示） 。图 1 免疫阳性细胞呈现棕黄色淡染颗粒 3 讨论 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一组含 Zn2+的能降解细胞外间质的蛋白酶,通常在中性条件下发挥活性，有 Ca2+参与时活性最大。MMPs 在基底膜降解中起着主要作用。可以诱导 MMP 表达的有白介素1(IL1) 、IL6 、肿瘤坏死因子 (TNF) 、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、和转化生长因子(TGT) 。
10、MMP 的蛋白水解酶活性受非特异性和特异性抑制因子的抑制。非特异性因子包括 2 巨球蛋白、1 抗蛋白酶和BB94(Batimistat) ，特异性抑制因子为基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitory fmetalloproteinase,TIMP)。微血管的完整性在局灶性缺血时被破坏，其中 MMP2 和 MMP9 与脑血管病联系的研究较多。MMP2 酶原分子量为 72 kD，活性分子量为 66 kD；MMP9 酶原分子量为 92 kD,活性分子量为 83 kD。MMP2 和 MMP9 一经合成即以无活性形式从细胞内分泌到细胞外，在体内被特殊的蛋白酶切割而产生活性。MMP2
11、的主要底物包括明胶,胶原 IV、V 、VII、X,层粘连蛋白,弹性蛋白及纤连蛋白；MMP9 的主要底物包括明胶，胶原 IV、V，弹性蛋白。研究3，4发现 MMP9 在心脑血管疾病中起重要的作用，它的激活和脑血管关键蛋白成分的降解与出血和水肿的发展相关5，6 。脑毛细血管壁以 IV 型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白作为基底膜的主要组成成分。局灶性缺血可以引起基底膜通透性和结构的变化,这种变化已经被认为是局灶性缺血所致微血管出血的主要原因。本研究发现 MMP2 的表达有时间依赖性，MMP2 在缺血 6 h 未见表达增加，24 h 出现表达增加，缺血后 5 d 达高峰，这正是血管生成及神经胶质增生出现的
12、时间，提示MMP2 在修复过程中作用轻重，而且有助于血管生成及神经胶质增生。星形细胞主要通过 MMP2 调节血脑屏障。Heo 等7对 27 例清醒状态下灵长类动物 MCAO/R 的不同时期进行了研究，大脑中动脉阻断后 1 h 基底神经节的 MMP2 前体的含量明显增加，并且之后持续升高。MMP2 的表达与神经元受损范围和数量高度相关(r=09763 ，SE=0004 ，P=00008) 。而 MMP9 活性在同一时期变化较小(P=011), 并且与神经受损范围和数量无相关性(r=0.455，SE=0289 ，P=0033) 。而在局部脑缺血所致出血变化发生时,MMP9 表达明显升高(P=0.0
13、13)，此时 MMP2 不升高(P=0.57)。这些发现提示了 MMP2 在降解基底膜致神经原损伤及 MMP9 在局灶性缺血所致出血变化中的早期潜在作用。Rosenberg 等8较早发现在大鼠脑内注射 MMP2 可促使 BBB 开放。脑缺血后 MMP2 及 MMP9 通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜,继而引起血管源性脑水肿。他们随后的研究又发现持续大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠在缺血后 2448 h 脑水肿达到高峰,与脑内 MMP9 活性增高的时间一致。5 d 后 MMP2活性较对照组才明显增高,推测 MMP2 可能与损伤后组织修复有关。Anthony 等9发现9 在中风一周后
14、病人脑组织的中性粒细胞有强烈表达，而 MMP2 染色远不如 MMP9 明显。中风一周后到 5 年,脑实质中性粒细胞消失,但存在大量表达 MMP2 的巨噬细胞。说明 MMP9与中风急性期 BBB 及脑组织破坏有关,而 MMP2 可能在缺血后组织修复、神经再生过程中起作用。以上结果存在部分差异,可能是 MMPs 的表达依据脑损害的性质和时间长短有个体差异,也可能与实验设计本身有关。但在 MMP2 、MMP9 可降解 ECM,改变血管通透性,参与血管源性脑水肿和脑出血机制，影响缺血性卒中的转归和预后方面已有共识。我们期待得到更成熟、一致的结论。 【参考文献】 1 Busch E,Kruger K,H
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