1、大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的【摘要】 目的 研究肝细胞因子受体编码基因 cmet 在大鼠胰腺发育不同阶段的表达及其编码蛋白的细胞定位。方法 采用 RTPCR 技术检测 cmet 基因在大鼠胰腺不同发育时期：孕 15.5 d（E15.5）和孕 18.5 d(E18.5)、生后 14 d(P14)、生后 21 d（P21)、新生及成年胰腺的表达；并用免疫组化技术检测该基因编码的蛋白 cMET 在胰腺发育不同阶段的细胞定位。结果 cmet 基因在 E15.5、E18.5 d 较成年特异性高表达，免疫组化结果显示该基因编码的蛋白 cMET 在新生后的胰腺大量定位于胰岛细胞。结论 cmet 可
2、能在胰腺发育过程中起到调控作用，参与胰腺发育中新生后胰岛结构重塑过程。 【关键词】 cmet ；胰腺生长发育；RTPCR ；免疫组化 【Abstract】 Objective To investigate the expression and location of cmet protooncogene in the different development stages of rat pancreas.Methods Using RTPCR to detect the expression of cmet protooncogene in different development sta
3、ges of rat pancreas:embryonic day 15.5，embryonic day 18.5，postnatal day 14，postnatal day 21，newborn and adult pancreas. Using immunohistoche to detect the location of the protein of cmet protooncogene in the different stages of rat pancreatic development.Results cmet protooncogene expresses highly a
4、t rat postnatal days, espacially at P14、 P21of rat pancreatic development stages .Conclusion cmet protooncogene may play a role in the development of rat pancreas espaciallyin the islet remodation of postnatal rat pancreatic development. 【Key words】 cmet protooncogene ，pancreatic development，RTPCR 近
5、年来，原癌基因 cmet 受到越来越广泛重视。其编码蛋白的不同亚型异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关13 。自 Lobstein 和 Recamier 提出肿瘤的胚胎性源性概念以来,胚胎细胞与恶性肿瘤细胞生物学的比较研究日益受到了人们关注4 ，肿瘤细胞的发生、发展和胚胎发育过程存在一定的相似性57 。在人类该基因全长为 6 641 bp,存在不同转录本，大鼠该基因全长 4 189bp,编码形成的 cMET 蛋白与人类的 cMET 蛋白具有高度的同源性。2004 年 Atsushi 等用流式细胞仪在成年小鼠胰腺导管上皮细胞检测到 cMET 蛋白的表达8 。而该蛋白在胰腺发育不同阶段的表达及定
6、位，未见明确报道。 本研究以 SD 大鼠为模型，选取孕 15.5 d（E15.5） 、孕 18.5 d（E18.5）及新生、生后 14 d(P14)、生后 21 d(P21)及成年这几个大鼠胰腺发育和功能完善的关键时期，通过 RTPCR 技术对 cmet 原癌基因在胰腺发育不同阶段的表达做出初步分析，并用免疫组化技术对该基因所编码的蛋白在大鼠胰腺不同发育阶段的表达进行定位分析，为揭示cmet 基因在胰腺发育细胞功能完善过程中的作用提供了一定依据，为临床糖尿病的治疗新途径提供一定的理论数据。 1 材料与方法 1.1 材料 成年 SD 大鼠 60 只，雌 20 只，雄 40 只，体质量 250 g
7、左右，由滨州医学院动物中心提供。mastercycler PCR 仪（Eppendorf公司）,Trizol Reagent(美国 Gibco 公司) , RNAeasy Mini Kit (Qiagen) , RTPCR 试剂盒(Tayobo)，羊抗鼠单克隆抗体（美国 Santa cruz 公司） ，兔抗羊二抗（福建迈新公司） 。 1.2 方法 1.2.1 组织取材：于 6：00 PM 时，将雌雄大鼠以 12 合笼，次日检测有阴栓者，定为受精 0.5 d(E0.5) ，取 E12.5，E15.5 和 E18.5 胚胎胰腺以及新生鼠胰腺；取怀有胚胎 E15.5 和 E18.5 的母鼠，引颈椎脱
8、臼处死，分离出胚胎，显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后，迅速在液氮中冷冻。新生、P14、P21 和成年鼠直接分离出胰腺9 。 1.2.2 RTPCR 扩增：根据基因文库 cmet 的序列，用 Primer 5.0 设计 PCR 扩增引物。上游引物: 5CCACCCCAATGTTCTCTAC3,下游引物: 5GGTGGTGAACTTTTGCGTCT3 ，预计扩增产物 514 bp；引物由江苏赛百盛基因有限公司合成。 取 1 g 的 E15.5、 E18.5、新生、P14、P21 和成年六个时期（每组 5 只）胰腺组织总 RNA 进行反转录：反应条件为 30 10 min，42 20 min， 99
9、 5 min， 4 5 min，合成 cDNA。cmet 的 PCR 条件：引物：94 5 min； 94 30 s， 59.5 30 s， 74 1 min， 33 个循环。 RTPCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后在紫外光下进行观察照相。用捷达 801 系列凝胶分析软件进行凝胶密度扫描分析，计算待测基因 PCR 产物各条带密度与内对照 18sRNA 条带密度, 两者的比值作为待测基因 mRNA 表达的相对含量。同一条带重复测量 3 次。 1.2.3 免疫组化： 大鼠胰腺发育不同阶段标本均石蜡包埋,切片,常规脱蜡去水。3%H2O2 去离子水孵育 510 min ,蒸馏水冲洗, P
10、BS 浸泡 5 min。滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育 10 min。滴加 1 100 稀释的一抗( 单克隆抗体购自 Santa cruz 公司) ,37孵育 1 h , PBS 冲洗 3 次。滴加二抗(二抗购自福建迈新公司) ,37孵育 20 min 。PBS 冲洗 3 次,显色剂显色(DAB) 。自来水充分冲洗后,选择封片剂封片。 2 结果 2.1 RTPCR 结果 用 RTPCR 技术检测 cmet 原癌基因在大鼠胰腺发育 E15.5、E18.5、新生、P14、P21 及成年阶段的表达，结果如图1，经灰度值扫描分析得知该基因在大鼠胰腺胚胎发育期的表达量明显高于成年阶段。 22 免
11、疫组化结果 用免疫组化技术检测 cmet 原癌基因所编码的蛋白在大鼠胰腺发育 E15.5、E18.5 新生、P14、P21 及成年阶段的表达定位，如图 2，结果显示在大鼠胰腺新生、P14、P21 这三个阶段 cmet原癌基因所编码的蛋白大量定位于胰岛细胞。 3 讨论 胰腺发育是一个复杂的过程，胰岛结构的形成和生物学功能发挥是一个重要环节。目前，虽然对胰腺胚胎发育的研究在形态学上已明确，但在分子网络调控机制上却尚不明确 。功能学研究已经证实在胰腺的整个发育过程中信号通路和转录因子起着非常重要的作用，如 FGF, Hedgehog, Notch，TGF /activin 等信号通路以及 HNF1
12、(Tcf1 ),HNF1 (Tcf1 ), HNF4 (Tcf4 ), Pdx1, NeuroD1,Ngn3, Pax4, Pax6 等转录因子10,11 。 原癌基因 cmet 编码肝细胞生长因子受体 cMET ，该受体是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的受体，属于酪氨酸激酶 src 家族。受体与配体结合后导致受体上的酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基能与含 SH2 功能区的胞内信号转导蛋白结合，激活细胞内多个信号导联，从而产生多种效应：促有丝分裂，调节细胞生长，对组织器官的发育产生影响1214 。 我们前期实验室所作多居寡核苷酸芯片检测结果显示，cmet 转录调控基因在大鼠胰腺发育过程中的表达趋势
13、与 cmet 高度相似。cmet受体信号系统的激活首先是 cmet 上酪氨酸蛋白激酶（PTK）激活，激活的 PTK 先使受体自身酪氨酸磷酸化，同时受体自身酪氨酸磷酸化后进一步激活 PTK, PTK 再激活靶蛋白上的酪氨酸磷酸化，经过瀑布式的磷酸化反应，将外界信号逐级放大，最终传至细胞核内，导致细胞增殖、分化。其信号传导通路发挥作用有组织器官特异性。芯片结果显示在大鼠胚胎胰腺的发育过程中，cmet 信号传导主要是经过 MAPK 和 stat 通路。而 MAPK 的激活包括依赖 ras 和非 ras 依赖，芯片中并没有检测到 ras 的存在，故 cmet 胰腺中激活，可能是非 ras 途径，通过
14、PKC 激活MAPK12，13 。信号系统激活后引起细胞核内一系列转录因子cfos 、Akt 的表达，控制细胞生长及 DNA 合成，细胞周期素 A、B、D和 E 等的含量也发生变化，最终细胞进入增殖期15 。 此次实验检测到 cmet 的 mRNE 表达水平在大鼠胰腺胚胎阶段表达量较高，而继胚胎发育期之后的新生后发育阶段检测到 cMET 蛋白表达量较高，这进一步提示 cmet 及其编码蛋白极有可能是调控胰腺发育的功能蛋白，且其功能蛋白发挥作用有可能在大鼠胰腺发育的生后胰岛结构重塑阶段 【参考文献】 1 Habener JF, Kemp DM, Thomas SK,et al.Minirevie
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