1、多孔双相钙磷陶瓷在脊柱后路融合中成骨作用和降解特性的组织学观察作者：谢幼专，朱振安，张蒲，汤亭亭，卢建熙，戴尅戎【摘要】 目的了解多孔双相钙磷陶瓷在人体脊柱后路融合中的成骨变化及降解过程。 方法对 20 例脊柱后路融合的双相钙磷陶瓷活检标本行不脱钙硬组织切片检查。观察陶瓷周围和内部的新生组织、陶瓷的形态改变、降解颗粒及伴随的细胞吞噬反应。其中 14 例标本行组织形态计量，根据患者的年龄、植入时间及临床结果分组比较成骨及材料降解的速度。 结果所有的双相钙磷陶瓷标本均可见新生骨组织，与自体骨接触越多，陶瓷内的新生骨组织越多。绝大部分陶瓷内可见降解颗粒，部分颗粒位于巨噬细胞内。不同标本的新生骨和材料
2、降解速度差异较大。陶瓷内的新生骨随植入时间的增加而增多，但随患者年龄的增大而减少。陶瓷的降解率随患者年龄的增大而减少，但不受植入时间的影响。后路融合成功组的活检标本的新生骨量高于融合失败组，但材料降解率则反之。 结论多孔双相钙磷陶瓷是一种骨传导材料，但植入体内降解缓慢，不能被新生骨组织完全替代。植入时必须将陶瓷与自体骨充分混合以获得良好的骨长入。陶瓷产生的降解颗粒及诱发的细胞吞噬反应必须引起注意。 【关键词】 脊柱后路融合； 双相钙磷陶瓷； 骨形成； 生物降解Abstract：ObjectiveTo reveal the osteogenesis, the biodegradation and
3、 tissue reactions of the porous biphasic calcium phosphate ceramic (PBC) in human spine.MethodThe histological study was carried out on 20 PBC samples retrieved from posterior spinal fusion. All the PBC samples were treated by undecalcified histological preparation. The tissue in or around the mater
4、ial, the change of ceramic shape,the particles and the presence of macrophages were observed. The quantitative study was performed in 14 samples with sufficient size. The residual material and the newly formed bone were analyzed according to the patient age，the duration in vivo and clinical results.
5、ResultNewly formed bone was found in all the samples. More new bone was formed in those samples closely in contact with autogenous bone. The PBC degradation particles were present both in the macrophages and around the tissue. But those phenomena were highly variant among the samples. New bone forma
6、tion increased with time and decreased with the age. The material degradation decreased with the age, but it did not differ greatly with time. New bone formation was higher and the residual material was lower in the fusion group than in the nonfusion group.ConclusionThe PBC is a kind of osteoconduct
7、ive material and does not transform into new bone after a relatively long time. The PBC should be well mixed with the autogenous bone in order to achieve high new bone colonization. The PBC degradation particles and related active phagocytotic activity have been noted.Key words：posterial spinal fusi
8、on; calcium phosphate ceramic; osteogenesis; biodegradation退行性椎间盘病变、脊柱不稳和脊柱侧弯等疾病的手术治疗常需进行脊柱后路融合。自体骨移植是促进融合的金标准方法，但自体骨供区并发症的发生率可高达 24%。此外，自体骨的取骨量有限，不能满足日益增加的翻修手术需求。尽管融合时也可采用同种异体骨，但免疫排斥反应及潜在传播传染性疾病的可能又使其应用受到一定的限制。近年来，人工合成的多孔双相钙磷陶瓷日益受到重视并应用于临床,且在动物1和人体2的脊柱后路融合中取得了良好的效果。然而，大多数临床研究主要以影像学改变和临床症状、体征的改善为评判标
9、准，组织学活检观察甚少。大多数组织学观察来源于动物实验研究，但由于物种的差异，低等脊椎动物的实验结果不能完全代表人体的生物学改变。由于组织学观察能最直观地了解这些材料在人体内的生物学变化，因此，本研究对 20 例脊柱后路融合手术的多孔双相钙磷陶瓷活检标本进行组织学观察，以较真实地了解其在人体的生物学改变。1 材料与方法1.1 病例资料19932002 年法国 Calot 医院共收集 20 例多孔双相钙磷陶瓷活检标本，均取自脊柱后路融合的患者。其中男 2 例，女 18 例；年龄 1170岁（平均 45.2 岁） 。原发性诊断包括先天性脊柱侧凸畸形（1 例） ，特发性脊柱侧凸畸形（11 例） ，退
10、变性脊柱侧凸畸形（7 例） ，腰椎不稳（1 例）。最大融合范围从 T1 至骶骨。每例融合手术均使用内固定器械固定，双相钙磷陶瓷和自体骨混合植骨。活检时间为术后 256 个月（平均 24 个月） 。所有活检均在患者行第次脊柱后路手术时进行。患者接受次手术的原因包括内固定器械拆除（6 例） 、融合失败（8 例） 、融合区临近节段椎间盘突出（3 例） 、腰椎不稳（2 例） 、重置内固定（1 例） 。活检标本来源于腰段（15 例） 、胸腰段（1 例） 、胸段（1 例） ，有 3 例标本取自的节段未详细记载。1.2 植入材料本组患者中，17 例应用条状双相钙磷陶瓷（5 mm5 mm20 mm） ，3 例
11、应用颗粒状陶瓷（直径 13 mm） 。该陶瓷由磷酸三钙（40%）和羟基磷灰石（60%）组成，孔径为 300600 m，孔隙率约为 50%10%。脊柱后路融合采用混合植骨，即双相钙磷陶瓷与局部去皮质骨粒（16 例）或自体髂骨（2 例）混合移植。2 例自体骨来源记载不明。1.3 组织形态学观察及计量所有标本在取材后立即用 10%中性福尔马林浓液固定，14 d 后用梯度乙醇浓液脱水，甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯包埋。应用 Leica 锯式切片机切片，切片初始厚度约为 200 m，研磨至约 50 m 厚，抛光后用苦味酸-品红溶液染色。每个标本观察 2 张连续切片。观察指标有：双相钙磷陶瓷周围和内部的新生
12、组织；陶瓷形态的改变；颗粒及伴随的细胞反应。本组标本中，6 例因体积过小，无法进行定量研究，仅进行形态学观察；其余 14例标本较大，且均为条状陶瓷，进行组织形态计量学测量。测量的指标主要有：(1)新骨形成率（VPB）=陶瓷内部形成的新骨面积/陶瓷孔的总面积；(2)材料残余率（VRM）=残存的陶瓷面积/植入陶瓷的总面积；(3)新骨占孔率（NbB）=形成新骨的孔数/总的孔数；(4)材料周边的骨接触率（PIB）=与骨接触的材料周长/材料的总周长。1.4 统计学处理所有结果用均数表示。植入时间与新骨形成率（VPB） 、新骨占孔率（NbB）之间的关系采用 Spearman 秩相关分析，同法分析材料周边的
13、骨接触率（PIB）和新骨形成率（VPB） 、新骨占孔率（NbB）之间的关系。2 结 果所有的双相陶瓷标本均可见新骨形成，但不同病例的新骨形成率差异较大。11 例陶瓷标本内可见大量的新骨形成(图 1a)，9 例标本仅在陶瓷周围的孔内形成新骨(图 1b)。与自体骨紧密接触的陶瓷中形成的新骨较多。仅形成少量或未形成新骨的陶瓷孔内可见纤维组织形成。从整体上看，双相钙磷陶瓷的骨架结构变化不大，孔连接径大小很不均一。陶瓷周围和内部可见降解颗粒，其中 19 例标本观察到数量不等的材料降解颗粒，颗粒周围可伴随活跃的多核巨细胞，细胞内可见吞噬的降解颗粒(图 2a，2b)。一些降解颗粒和吞噬细胞位于材料的表面，但
14、在形成新骨的陶瓷表面，未见降解颗粒。14 个标本行组织形态学计量测量，植入时间为 243 个月，新生骨组织为 33%（VPB）或 38%（NbB） 。陶瓷周边的骨接触率为 19%。材料残余率为 52%，与植入前变化不大。根据患者年龄将 14 例陶瓷标本分为 3 组：少年组（20 岁）3例；青中年组（2050 岁）6 例；老年组（50 岁）5 例。结果表明材料的残余率随年龄增大而增多，新生骨随年龄组增大而减少。新骨形成率最大的病例出现在少年组内，达 81.8%(图 3)；新骨形成率最小的病例出现在青中年组内，仅 0.6%。根据陶瓷植入体内的时间分 3 组：1 年内 3 例，12 年 5 例，2
15、年以上 6 例。结果发现材料内新生的骨组织随植入时间的延长而增多，材料残余率随植入时间变化不大。根据最终是否融合成功分为 2 组：融合成功组 9 例，融合失败组5 例。结果显示融合成功组新骨形成率（VPM，37%；NbM, 41%）明显大于融合失败组（VPM，24%；NbM, 33%） 。材料的残余率则融合成功组（51%）低于融合失败组（53%） ，即融合成功组的材料降解较快。相关分析研究发现植入时间与新骨形成率 VPB（r=0.05, P=0.86） 、新骨占孔率 NbB(r=0.14, P=0.62)无显著相关，但材料周边的骨接触率PIB 与新骨形成率 VPB（r=0.84, P0.01）
16、 、新骨占孔率 NbB(r=0.81, P0.01)呈显著相关。3 讨 论应用多孔双相钙磷陶瓷促进脊柱后路融合已取得较好的临床效果。双相钙磷陶瓷由磷酸三钙和羟基磷灰石组成，具有与骨基质相同的化学成份，多孔结构有助于骨髓基质干细胞移行、贴附、增殖和分化为成骨细胞，可作为骨传导性支架促进骨长入，因此本研究中的所有陶瓷均形成不同数量的新骨。但不同病例的新生骨量的差异较大，这是由于脊柱的融合过程还受到如患者年龄、植入材料、植入部位的机械环境及植骨床的准备情况等因素的影响。图 1a 双相陶瓷的周围孔及中心孔均可见新骨形成，陶瓷周围与自体骨(星号)紧密接触。 （苦味酸品红染色，3.125） 图 1b 双相
17、陶瓷的周围孔形成少量类骨质（箭头）和矿化骨（星号） ，中心孔见纤维组织形成，无新骨。注意陶瓷周围无自体骨。 （苦味酸品红染色，3.125） 图 2a 双相陶瓷的孔内可见新骨形成，周围有大量的降解颗粒。 （苦味酸品红染色，50） 图 2b 高倍视野下可见陶瓷降解颗粒位于多核巨细胞内或细胞外。 （苦味酸品红染色，100） 图 3 来源于 19 岁患者的双相钙磷陶瓷标本，可见大量新骨（类骨质：黄绿色；矿化骨：红色）形成，陶瓷表面覆盖新生骨，未见降解颗粒。 （苦味酸品红染色,25）从材料结构上分析，双相钙磷陶瓷的孔与孔连接的不均一可引起本研究中不同病例间新生骨量的差异。研究表明孔径为 300 600
18、m的陶瓷适于骨组织长入3 ，孔连接径为 30 m 的陶瓷比 60 m 的陶瓷形成的纤维组织多，孔连接径大于 50 m 能确保矿化骨的形成3 。本组材料具有良好的孔径（300600 m） ，但孔连接径大小很不不均一，而导致新生骨量的差异。此外，羟基磷灰石在体内难以降解，而磷酸三钙植入体内周后就开始降解，因此，当双相钙磷陶瓷的磷酸三钙成分开始降解后，羟基磷灰石仍未降解，材料的大体骨架仍然存在，材料的孔与孔连接也不会发生显著改变。本组钙磷陶瓷植入后残余材料的孔隙率与植入前变化不大，表明材料本身的结构未发生明显的改变或材料未降解。有些陶瓷植入体内长达 4 年余，但仍未能降解消失或转化成骨组织，因此，双
19、相钙磷陶瓷仅是一种骨传导性支架，而非骨替代物，双相钙磷陶瓷不会被新骨完全替代4 。近年研究表明引入干细胞或诱导因子能促进其成骨5 。本研究发现陶瓷内新生骨量随年龄增加而减少，随植入时间的延长而增加；一少年患者植入双相钙磷陶瓷 38 个月后，陶瓷活检标本显示其新生骨量最大，达 81.8%。这一结果表明双相陶瓷的成骨量受患者的年龄和植入时间的影响：青少年的成骨活动较活跃，新生骨量也较大。此外，陶瓷内成骨量还与融合技术有关。近年研究表明双相陶瓷必须与自体骨（如局部去皮质骨粒）混合植入，与自体骨紧密接触的陶瓷的新生骨明显增多1 。本研究发现未接触自体骨的双相钙磷陶瓷成骨量较低(0.6%22%)，相关分
20、析表明植入钙磷陶瓷与自体骨接触越紧密、越多，陶瓷内部形成的新骨越多，与文献报道一致，这是因为植骨床、植骨块或去皮质骨粒在新骨长入的过程中起重要的作用。去皮质良好的植骨床及局部骨片能提供含骨髓干细胞的骨髓，而良好的接触能确保来自于植骨床或自体骨块的骨髓基质干细胞抵达陶瓷，从而促进陶瓷内部和周围形成新骨，因此，行脊柱后路融合时必须将植骨床充分去皮质化，并使植骨块或去皮质骨粒与钙磷陶瓷充分混合，使其相互接触，才能确保较多地骨长入。双相钙磷陶瓷的生物降解过程较复杂，机械磨擦、化学溶解、细胞吞噬及细胞活动产生的酸性环境都能使其降解6 。此外，陶瓷的烧结工艺对陶瓷的降解有重要的影响。为了保证双相钙磷陶瓷中
21、的有效成份，烧结温度往往较低，使磷酸三钙颗粒、羟基磷灰石晶体间的连接较弱，植入体内后易形成降解颗粒，诱发细胞吞噬反应6, 7 。由于羟基磷灰石颗粒较难溶解，细胞吞噬后会引起细胞损伤，从而影响骨形成和脊柱融合7 。由于本研究中最早的病例和最迟的病例相差达 8年之多，使用的双相陶瓷可来自不同的批号，这些因素都可影响本研究中各标本的成骨和降解。本研究所有病例在植骨融合的同时都进行了内固定术，因此所有植入的双相陶瓷具有稳定的生物力学环境，但从严格意义上说，脊柱后侧和后外侧融合的生物力学环境不尽相同，动物实验表明横突间融合术陶瓷的新骨形成率明显低于椎板间融合术。本研究部份病例的融合部位在腰段，标本的取材
22、部位可为椎板、关节突或横突间。由于具体活检部位的记载不够详尽，因此不能进一步分析这些差异，今后根据不同植入部位进一步研究有助于阐明这些差异。4 致 谢感谢法国 Calot 医院骨科 Chopin 医师和 Morin 医师热情地提供临床标本，感谢法国 Littoral 大学生物材料和生物技术研究所 Hardouin教授对研究所作的悉心指导。【参考文献】1 Delecrin J, Deschamps C, Romih M, et al. Influence of bone environment on ceramic osteointegration in spinal fusion: compa
23、rison of bonepoor and bonerich sitesJ. Eur Spine J, 2001,10:110-113.2 Fujibayashi S, Shikata J, Tanaka C, et al. Lumbar posterolateral fusion with biphasic calcium phosphate ceramicJ. J Spinal Disord, 2001, 14:214-221.3 Flautre B, Descamps M, Delecourt C, et al. Porous HA ceramic for bone replacemen
24、t:role of the pores and interconnectionsexperimental study in the rabbitJ. J Biomed Mater Res,2001,12:679-682.4 Totoribe K, Tajima N, Chosa E, et al. Hydroxyapatite block for use in posterolateral lumbar fusion: a report of four casesJ. Clin Orthop,2002,399:146-151.5 许卫兵，贾连顺，卢建熙,等. 兔骨髓基质干细胞体外培养复合-磷酸
25、三钙进行胸椎后侧融合实验研究J. 中国矫形外科杂志,2005,22:1736-1738.6 Lu J, Descamps M, Dejou J, et al. The biodegradation mechanism of calcium phosphate biomaterials in boneJ. J Biomed Mater Res,2002,63:408-412.7 Lu J, Blary MC, Vavasseur S, et al. Relationship between bioceramics sintering and microparticlesinduced cellular
