1、莪术醇对斑马鱼胚胎发育的影响作者：田丽莉，董建勇，黄长江【摘要】 目的 ：研究莪术醇对斑马鱼胚胎发育的影响。方法：以孵育 6 h 的斑马鱼胚胎为实验模型，设空白对照组和莪术醇组，观察记录发育畸形、孵化率、心率、自主运动次数及仔鱼的泳速。结果：莪术醇可致斑马鱼身体弯曲，EC50(96 h)为 51.17 mgL-1;能明显降低胚胎孵化率(P0.05);使心率显著降低(P0.05)，且呈剂量依赖性。低浓度莪术醇可显著促进斑马鱼自主运动(P0.01);能明显减小仔鱼的泳速(P0.05)。结论：莪术醇对斑马鱼胚胎的发育有一定影响。 【关键词】 莪术醇;斑马鱼胚胎;畸形;孵化率;心率;自主运动;泳速Ab
2、stract: Objective: To study the developmental effects of Curcumol on embryo-larval zebrafish. Methods: The 6 h post-fertilization zebrafish was randomly divided into control group and different concentration of the Curcumol groups based on concrete experiment，then non-lethal malformation，hatching ra
3、te，heart beat，spontaneous movement and swimming velocity were observed and recordedin detail at specified stages. Results: The abnormality of zebrafish was observed with EC50 (96h) 51.17 mgL-1 for curved body axis;Curcumol made hatching rate lower(P0.05)，heart beatdecreased(P0.05)in concentration-de
4、pendent way. The low concentration Curcumol could stimulatespontane-ous movement(P0.01)and reduce the swimming velocity compared to the control group.Conclusion: Curcumol is developmentally toxic effect on zebrafish in early life stage.Key words: Curcumol;zebrafish;malformation;hatching rate;heart b
5、eat;spontaneous movement;swimming velocity莪术醇是莪术油主要有效成分之一1。 中国药典(2005 年版)规定莪术醇为临床抗病毒、抗肿瘤用药莪术油质量控制的指标成分。莪术醇在体外能抑制金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌的生长2;对呼吸道合胞病毒有直接抑制作用，对流感病毒 A 和 A3型有直接灭活作用3-4。莪术醇也是一种有发展前途的抗肿瘤药物5，可通过与半胱天冬蛋白酶无关的线粒体途径诱导人肺腺瘤(ASTC-a-1)细胞凋亡6。但莪术醇毒理学的研 究鲜见系统文献报道。近年来，斑马鱼生物模式愈多地应用于药物毒性评价7。本实验以斑马鱼胚胎为模型
6、，研究莪术醇对斑马鱼胚胎的发育毒性，为临床安全用药提供初步研究资料。1 材料和方法1.1 动物无病原体 AB 品系斑马鱼，由温州医学院水域科学与环境生态研究所提供。斑马鱼饲养于全封闭循环系统，养殖和繁殖均参照 Zebrafish Book 标准，鱼房内光照/黑暗比为 14/10，室内温度 26 ，水温 28 ，pH 6.87.5，电导率 850900，其各项水质指标均合要求。取健康性成熟的斑马鱼，雌雄交配繁殖获得受精卵。将受精卵收集清洗后移入培养皿，在光照/黑暗比为 14/10、28 的人工气候箱内孵育至 6 h。1.2 试药与仪器莪术醇由本实验室从莪术油中分离得到，经气相色谱鉴定纯度为99.
7、2%;二甲基亚砜(分析纯、批号 0902106、上海展云化工有限公司);Rxz 智能型人工气候箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司);Nikon Eelipsete2000 倒置显微镜(日本尼康公司);PB0105J 运动测试仪(法国View Point 公司)。1.3 方法1.3.1 溶液配制：斑马鱼胚胎培养液参照 Zebrafish Book 标准：0.137 molL-1 NaCl、5.4mmolL-1 KCl、0.25 mmolL-1 Na2HPO4、0.44 mmolL-1 K2HPO4、1.3 mmolL-1 CaCl2、1.0mmolL-1 MgSO4、4.2 mmolL-1 N
8、aHCO3;莪术醇用 DMSO 助溶配制母液，实验前用斑马鱼胚胎培养液稀释获得工作液，DMSO 终浓度小于 0.1%8。根据预实验设空白对照组(胚胎培养液)和不同浓度试药组。1.3.2 斑马鱼胚胎畸形和孵化率测定：设空白对照组和莪术醇试药组(2 mgL-1、10 mgL-1、20 mgL-1、40 mgL-1)。取 96 孔板，按实验不同分组，每孔加入 200L 工作液，将孵育 6 h 的健康胚胎随机放入各孔中，每孔 1 枚，每组 30 枚。于人工气候箱中继续孵育至 96 h。在显 微镜下观察记录各组胚胎的孵化和畸形。1.3.3 斑马鱼自主运动和心率测定：设空白对照组和莪术醇试药组(2 mgL
9、-1、10 mgL-1、20 mgL-1、40 mgL-1)。取 6 孔板，按实验不同分组，每孔加入 5 mL 工作液，将孵育 6 h 的健康胚胎随机放入各孔中，每孔 10 枚，即每组 10 枚胚胎。于人工气候箱中继续孵育至 24 h，在显微镜下观察各组胚胎 20 s 内自主运动，以斑马鱼尾部摆动为准，尾部摆动一次即计数一次，并用软件 NIS-Elements F 2.30 录像记录;分别在胚胎孵育 36、48、52、60 和 72 h 时， 在显微镜下用计时器计数各组胚胎在 10 s 内的心跳次数。1.3.4 斑马鱼孵化后仔鱼的运动行为测定：设空白对照组和莪术醇试药组(0.1 mgL-1、1
10、 mgL-1、10 mgL-1)。取 96 孔板，按实验不同分组，每孔加入 200L 工作液，将孵育 6 h 的健康胚胎随机放入各孔中，每孔 1 枚，每组 10 枚，于人工气候箱中继续孵育至 96 h。分别转移出各组孵化的仔鱼，用胚胎培养液润洗后置预先加有 2 mL 胚胎培养液的 24 孔板中，每孔 1 个，每组 10 个。继续在人工气候箱中至 120 h。用斑马鱼行为分析系统，在正常光照(连续光照)和光刺激(光照和黑暗交替)下，通过 View Point Application Manager 软件记录并分析斑马鱼的运动速度。1.4 统计学处理方法组间比较采用 t 检验。2 结果2.1 莪术
11、醇对斑马鱼胚胎发育畸形和孵化率的影响莪术醇可导致斑马鱼胚胎发育畸形，表现为孵化后身体弯曲，其EC50(96 h)为 51.17 mgL-1;高浓度组(40 mgL-1)孵化率明显降低，与空白对照组相比差异有显著性(P0.05)，其余组无明显影响。结果见图 1-2。2.2 莪术醇对斑马鱼自主运动的影响低浓度试药组(2 mgL-1、10 mgL-1)自主运动次数显著增多，与空白组相比差异有显著性(P0.01)。但随着试药浓度升高效应下降，试药组 40 mgL-1 自主运动次数为 0。结果见图 3。2.3 莪术醇对斑马鱼心率的影响从斑马鱼胚胎孵育 36 h 到 72 h，各试药组心率与空白对照组相比
12、均下降。在 52 h 时，与空白组相比差异均有显著性(P0.01)。结果见图 4。2.4 莪术醇对斑马鱼仔鱼运动行为的影响在正常光照和光刺激下，试药组 0.1 mgL-1 斑马鱼运动明显减小，与空白对照组相比差异有显著性(P0.05)，其他试药组与空白对照组相比差异无显著性(P0.05)。结果见图 5-6。3 讨论斑马鱼属脊椎动物，是较好的活体研究体系，可保留药物代谢动力学过程;且繁殖发育能力强，胚胎在体外 1 d 的发育程度相当于人类胚胎 3 个月的发育，能为药物研究提供大量的 样本和较短的试验周期;胚胎透明，在显微镜下可清晰地看到血液循环、心脏跳动等心血管 功能及发育情况9;幼体对光反应强
13、烈，在行为学实验方面广泛应用10。因此斑马鱼生物模式便于检测分析中药的活性和毒性7。本实验以斑马鱼胚胎为模型，研究了莪术醇对其发育形态、孵化率、心率、自主运动和泳速的影响。结果表明，莪术醇可导致斑马鱼畸形，EC50(96 h)为51.17 mgL-1，且高浓度试药能显著降低胚胎孵化率。 中国药典(2005 年版)中规定莪术为妊娠禁用药。据文献报道，0.2%莪术醇药剂可使怀孕雌鼠胎仔发育畸形11。但莪术醇对胚胎致畸的作用机制有待于深入研究。斑马鱼心脏的发育是一个复杂的过程，需要细胞增殖、迁移、分化和不同起源的细胞之间的相互作用，与多种基因的表达与调控有关。心脏是胚胎发育过程中最早发生并发挥功能的
14、器官，完善的循环功能对于胚胎的正常发育起着关键作用。心率是体现心脏功能的一个重要指标，胚胎发育 48 h 后趋于稳定。本实验发现，莪术醇能导致斑马鱼胚胎心率明显降低，且呈剂量依赖性。但未见心脏组织形态的异常。斑马鱼在不同光照下的运动速度变化，直观地反映了身体各功能间的协调能力，是一种 简单有效地分析神经整合功能的方法10。斑马鱼发育初期的神经元称为原代神经元，是简 单神经系统的一部分，胚胎受精 24 h后，这些原代神经元开始分行;48 h 后，斑马鱼脑室形 成。当生物体暴露在环境物质中，引起神经系统正常行为改变时，即产生了神经毒性。研究 表明，化合物诱导下斑马鱼的神经细胞损害类似于在哺乳动物上
15、观察到的结果12。本实验 结果显示，莪术醇可影响斑马鱼的自主运动：低浓度促进，高浓度则抑制;能降低仔鱼泳速。结合莪术醇导致斑马鱼的身体弯曲分析，推测莪术醇对斑马鱼神经系统的发育有一定影响，其作用机制有待进一步研究。【参考文献】1 王琰,王慕邹.莪术的质量研究J.药学学报,2001,36(11):849-853.2 王浴生.中药药理与应用M.北京:人民卫生出版社,1983:872.3 阎田玉,郑企静,周光廷,等.莪术静脉注射液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎及其作用原理的研究J.中国中西医结合杂志,1992,12(12):711-7154 阎广信,傅文永,金慧敏,等.莪术油注射液治疗急性上呼吸道感染疗
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