1、法舒地尔对心肌急性梗死大鼠心肌组织Bc12 和 Bax 表达及血流动力学功能影响作者：潘娜娜 谭丽娟 马建英 【摘要】 目的 探讨法舒地尔对急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌组织Bc12 、Bax 表达及血流动力学功能影响。方法 选取雄性 Wistar 大鼠，结扎其左前降支制作 AMI 模型，将术后 24 h 存活的大鼠随机分为治疗组和 AMI 组。另随机选取 10 只大鼠作为假手术组，只在其左前降支下穿线不结扎。治疗组给予法舒地尔 5 mg/kg 腹腔注射，每日 2 次；AMI 组和假手术组给予等量生理盐水。4 周后分别测其血流动力学指标左心室收缩压（LVSP） ，左心室舒张末压（LVEDP）
2、， 左心室内压最大上升和下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax） ；RTPCR 法测定 Rho 激酶 mRNA 的表达；免疫组织化学方法测定凋亡相关蛋白 Bcl2 及 Bax 表达的变化。结果 AMI 组大鼠血流动力学指标、心肌组织 Rho 激酶 mRNA、凋亡相关蛋白 Bcl2及 Bax 表达与假手术组相比，差异均有显著性（F=14.79178.79,q=4.8524.95,P0.01） 。与 AMI 组相比，治疗组大鼠血流动力学指标改善，心肌组织 Rho 激酶 mRNA 表达减少，凋亡相关蛋白 Bcl2 表达增加，Bax 表达减少，差异均有显著性（q=3.2015.11,P0.0
3、5、0.01） 。结论 Rho 激酶参与了 AMI 后心肌细胞凋亡及心力衰竭的进展，法舒地尔通过抑制 Rho 激酶的表达减少细胞凋亡，保护缺血心肌，延缓心力衰竭进程。 【关键词】 心肌梗死；法舒地尔；Rho 激酶类；细胞凋亡；血流动力学 ABSTRACT Objective To investigate the effects of fasudil on the expressions of Bcl2,Bax and the hemodynamics in myocardium of rats with acute myocardial infarction (AMI). Methods A
4、model of AMI in Wistar rats was created by ligating left anterior descending coronary artery (LAD), for those survived for 24 hours after procedure were randomly divided into treatment group and AMI group. An additional 10 rats served as shamoperation group, the LAD was braided, but not ligated. Rat
5、s in treatment group were treated with Fasudil (5 mg/kg) intraperitoneally, twice a day, and those in AMI and shamoperation group were administered with equivalent volume of normal saline. Four weeks later, the hemodynamic pararmeters, i.e. left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular
6、 end diastolic pressure (LVEDP), the maximum rising and dropping rates of left ventricular pressure (+dp/dtmax, -dp/dtmax) were measured by catheterization. The expression of Rho kinase mRNA was measured by RTPCR, and expressions of Bcl2 and Bax protein measured by immunohistochemical staining. Resu
7、lts The differences of hemodynamic pararmeters, expressions of myocardial Rhokinase mRNA, Bcl2 and Bax, the apoptosisrelated proteins between shamoperation group and AMI were significant (F=14.79-178.79;q=4.85-24.95;P0.01). Compared with those of AMI group, the hemodynamics of treatment group improv
8、ed, the expressions of Rhokinase mRNA and bax decreased, and that of bcl2 increased (q=3.20-15.11;P0.05,0.01). Conclusion Rhokinase involvs in the postAMI myocardial cell apoptosis and the development of heart failure. Fasudil delays the process of heart failure through suppressing Rho expression, d
9、ecreasing cellapoptosis, and protecting ischemic heart muscle. KEY WORDS myocardial infarction; fasudil; Rho kinases; apoptosis; hemodynamics 急性心肌梗死(AMI)后，心肌坏死与细胞凋亡共同导致心肌细胞数量减少，且目前认为，心肌细胞凋亡的持续存在，使心肌细胞进行性丢失，导致室壁变薄，心室扩张，心室重构，最终发展为心力衰竭1。因此，防治 AMI 后心肌细胞的持续性丢失，抑制细胞凋亡，预防心室重构，延缓心力衰竭进程成为目前研究的焦点。研究表明，AMI 后心肌
10、细胞凋亡与Rho 激酶激活有关，法舒地尔是 Rho 激酶特异性抑制剂。动物实验证实，冠状动脉结扎术前 1 h 给予法舒地尔 30 mg/kg 腹腔注射，能够保护缺血心肌，减少心肌梗死面积，且该作用与其抗心肌细胞凋亡 2 期潘娜娜，谭丽娟，马建英. 法舒地尔对心肌急性梗死大鼠心肌组织Bc12 和 Bax 表达及血流动力学功能影响 129 效应有关2。但 AMI 后长期应用法舒地尔是否能够达到相似的效果，目前尚少有报道。本实验旨在观察 AMI 大鼠血流动力学指标改变及其心肌组织中 Rho 激酶 mRNA 表达、细胞凋亡相关蛋白 Bcl2 及 Bax 表达的变化，并探讨长期应用法舒地尔对上述指标的影
11、响。现将结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象与分组 雄性 Wistar 大鼠 62 只，体质量 250300 g，购于青岛市药检所。参照文献3经气管切开插管，呼吸机辅助呼吸，构建 AMI 模型，观察心电图变化，若有明显的 ST 段抬高，并见结扎下方心肌变白，室壁运动减弱，表明 AMI 模型制作成功，否则再次结扎。大鼠术后每天给予青霉素20 万单位肌肉注射, 连用 3 d。将术后 24 h 存活的大鼠随机分为 AMI 组（n=12）和治疗组（n=12） ；另随机选取 10 只大鼠作为假手术组，只在其左前降支下穿线不结扎。 1.2 方法 1.2.1 大鼠的处理 治疗组给予法舒地尔（天津红日
12、药业股份有限公司）5 mg/kg 腹腔注射，每日 2 次；AMI 组和假手术组给予等量生理盐水。各组均连用 4 周。1.2.2 血流动力学指标测定 4 周后，称大鼠体质量，100 g/L 水合氯醛麻醉，分离右颈外动脉，结扎其远心端，动脉夹夹闭近心端，20 G 静脉留置针向心方向插入血管直到动脉夹处，然后拔出留置针中的金属针，留下外面的塑料套管，连接血压换能器，并与 BL420 生物功能实验系统(成都泰盟科技有限公司)生理记录仪相连，整条管道及血压换能器内均需充满含有肝素的生理盐水，将塑料套管逆行送入左心室，连续记录左心室收缩压(LVSP)，左心室舒张末压(LVEDP)，左心室内压最大上升和下降
13、速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)，分别于 5、10、15 min 时各记录血流动力学指标 1 次，取 3次记录结果的平均值作为实验值。 1.2.3 Rho 激酶 mRNA 表达的测定 取心肌组织 50 mg，按试剂盒（杭州博日生物工程有限公司）说明提取细胞总 RNA，并采用 RTPCR 法行目的基因扩增。PCR 的特异性引物由上海生物工程科技有限公司设计合成。扩增 actin 基因(493 bp)上游引物的序列为：5TGTTTGAGACCTTCAACACCCC3 ，下游引物的序列为：5ACGTCACACTTCATGATGGAATTGA3 ；扩增 Rho 激酶基因(297 bp)
14、上游引物序列为：5GGTGATGGCTATTATGGACGAGA3 ，下游引物的序列为：5TCGGAGCGTTTCCCAAGC3 。根据以下条件进行目的基因扩增反应：预变性 94 3 min； 94 变性 30 s，退火 30 s（温度Rho 激酶 58 ，actin55 ） ，72 延伸 45 s，循环 35 次；最后72 终末延伸 5 min 后终止反应。取 10 L PCR 产物，于 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理，以 actin 作为内参照计算 Rho 激酶 mRNA 的相对表达量。 1.2.4 凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl2 的表达及结果判定 所有标本经
15、40 g/L 甲醛溶液固定，石蜡包埋，2 m 厚连续切片，免疫组织化学染色采用 SP 法，依照免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明书并按照文献4标准进行操作。结果判定：镜下观察 Bax、Bcl2 蛋白阳性反应呈黄色或棕黄色颗粒，弥漫性分布，定位于胞膜或胞浆。通过数码显微照相采集图像，每张切片随机选取 5 个高倍视野，应用 Image Pro Plus 图像分析系统进行计算机图像分析，统一参数设定保持基线一致。计算切片各视野阳性点面积总和及累积吸光度值，以半定量分析平均吸光度值表示 Bax 及 Bcl2 蛋白阳性表达强度。1.3 统计学处理 采用 SPSS 1.7 及采用 PPM
16、S 1.55统计软件进行统计分析，计数资料比较采用 2 检验，计量资料以s 表示，两组间比较采用 t 检验，组间多重比较采用单因素方差分析及 q 检验，P0.05 为差异有显著性。 2 结 果 2.1 大鼠生存状况 AMI 术后 24 h 存活的 24 只大鼠，在随后 4 周的干预期内共死亡 5 只，其中治疗组 3 只，AMI 组 2 只，死亡构成比分别为 25.00%和 16.67%，两组比较差异无显著性（P0.05） 。假手术组 10 只，无死亡。最后进入实验的 AMI 组 10 只，治疗组 9 只，假手术组 10 只。 2.2 血流动力学指标比较 与假手术组相比， AMI 组大鼠 LVS
17、P、+dp/dtmax、-dp/dtmax 显著降低、LVEDP 显著升高，差异均有显著意义(F=14.79178.79,q=7.6724.95，P0.01)；治疗组与 AMI 组相比，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 显著升高、LVEDP 显著降低，差异均有显著性(q=3.206.38，P0.05)。见表 1。表 1 各组大鼠血流动力学参数比较（略） 2.3 病理学改变 苏木精 伊红染色显示,假手术组左心室心肌横纹清晰，心肌纤维排列整齐；无肉芽组织和增生的纤维组织；心肌间质未见炎性细胞浸润。AMI 组与治疗组梗死区心肌纤维溶解断裂，心肌横纹消失，心肌组织被肉芽组织和增生的纤维
18、组织取代，梗死区有大量炎性细胞浸润；梗死边缘区由心肌纤维、纤维组织和肉芽组织构成；非梗死区心肌纤维排列整齐，心肌横纹清晰可见；梗死区与非梗死区边界清楚，表明心肌梗死模型制作成功。 2.4 心肌细胞 Rho 激酶 mRNA 及 Bcl2 与 Bax 蛋白表达的变化 AMI 组较假手术组 Rho 激酶 mRNA 及凋亡相关蛋白 Bax 表达明显增加，Bcl2 表达明显下降，差异均有极显著意义（F=20.3359.16，q=4.8510.38，P0.01） 。治疗组较 AMI 组心肌Rho 激酶 mRNA 及 Bax 表达减少，Bcl2 表达增加，差异均有显著性（q=5.2015.11，P0.01）
19、 。见表 2。表 2 各组大鼠缺血区心肌组织 Rho 激酶 mRNA 及 Bcl2 与 Bax 蛋白表达的比较（略） 3 讨 论 AMI 发生后， 尽快恢复缺血心肌再灌注，是挽救濒死心肌的根本措施，但大部分 AMI 病人因种种原因，失去了再灌注最佳时机，对于此类病人如何有效地保护存活心肌，减少心肌的进一步丢失，预防心室重构，保护心功能，是 AMI 治疗中的关键。 AMI 发生后，心肌有效工作细胞数量减少，心肌收缩力降低，泵血功能下降，导致 LVSP 及+dp/dtmax,-dp/dtmax 降低，进而引起 LVEDP 升高,并逐步进展为心力衰竭。目前的医学水平尚不能完全纠正其自然病程，但如何延
20、缓 AMI 引起的慢性心力衰竭的进程是当前心血管疾病研究与关注的焦点6。本实验结果显示，大鼠 AMI 后，LVSP 及+dp/dtmax,-dp/dtmax 较假手术组降低，LVEDP 升高（P0.01） ，AMI 后血流动力学参数的紊乱，反映了心脏的收缩和舒张功能严重损伤。本实验结果与理论相符。而连续给予法舒地尔 4 周后，却能改善血流动力学参数紊乱，升高 LVSP 及+dp/dtmax,-dp/dtmax,增强心肌收缩力，降低 LVEDP，减轻左心室前负荷，从而改善心功能。这与张曼等7通过大鼠升主动脉缩窄术制备心力衰竭模型，给予法舒地尔 4 周治疗后的结果相符。 目前认为细胞凋亡参与心肌梗
21、死的病理过程，是心肌梗死范围扩大和引起左心室收缩功能降低及早期重塑的重要因素8。本研究结果亦显示，AMI 大鼠心肌组织中 Rho 激酶 mRNA 表达升高，凋亡相关蛋白 Bax表达增加，Bcl2 表达减少。而应用法舒地尔治疗 4 周后，与应用生理盐水的 AMI 大鼠相比，心肌组织中 Rho 激酶 mRNA 表达降低，凋亡相关蛋白 Bax 表达减少，Bcl2 表达增加，差异均有显著性（P0.01） 。究其原因：Rho 激酶是小 G 蛋白的下游效应器之一，可参与多种细胞的生命现象。Rho 激酶的高表达和过度激活与多种疾病相关，目前尚未发现Rho 激酶低表达或活性不足所导致的疾病9。Rho 激酶能够
22、与多种血管活性物质相互作用，通过调控肌球蛋白轻链磷酸化和脱磷酸化，影响平滑肌细胞的功能和结构，直接参与心血管疾病的病理过程，与心血管疾病的发生发展密切相关。法舒地尔是 Rho 激酶特异性抑制剂，其主要通过与 ATP 竞争 Rho 激酶催化区结合位点，阻断 Rho 激酶的激活，在明显改善心功能的同时,心肌细胞内Ca2+i 却无明显变化7，从而可以减少心肌梗死后心肌细胞钙超载，减轻心肌损伤。本实验结果亦显示，心肌梗死后长期、小剂量应用法舒地尔能够降低 Rho 激酶 mRNA 表达水平，保护缺血心肌，改善心功能。细胞凋亡是在细胞外部因素刺激下由基因调控的主动性死亡过程，多种因素可通过调控凋亡相关基因
23、的表达，启动细胞凋亡进程。 Bcl2 与 Bax 是公认的与凋亡密切相关的调控蛋白。Bcl2 主要分布在线粒体外膜，可以调节膜通透性，主要功能是促进细胞生存，抑制细胞凋亡； Bax 位于胞质中，当 Bax 高表达时，可从胞质转位至线粒体膜，与 Bcl2 结合形成异二聚体，使之灭活，改变线粒体膜的通透性，引起线粒体损伤，促进细胞凋亡。心肌细胞凋亡是缺血和非缺血性心肌病心肌细胞死亡的主要形式之一，在心室重塑及心力衰竭的发生、发展过 2 期潘娜娜，谭丽娟，马建英. 法舒地尔对心肌急性梗死大鼠心肌组织Bc12 和 Bax 表达及血流动力学功能影响 131 程中起着重要的作用。 研究表明，Rho 激酶参
24、与细胞凋亡的各个阶段，在细胞凋亡的发生发展过程中起关键作用10，这其中的具体机制尚不明确。体外实验证明，腺病毒过度表达激活的 RhoA 作用于 Rho 激酶可导致心肌细胞肥大，通过上调 Bax 引起线粒体途径的心肌细胞的凋亡11。本研究结果亦显示，AMI 大鼠缺血区心肌组织中 Bax 表达较假手术组增多，同时 Bcl2 表达减少，而应用法舒地尔能够使 Bax 表达减少，Bcl2 表达增多，说明法舒地尔能够通过影响 Bcl2 及 Bax 的表达，保护心肌细胞，减少细胞凋亡，改善心功能。 综上所述，Rho 激酶特异性抑制剂法舒地尔，能够通过抑制 Rho 激酶的活性而减少 AMI 后心肌细胞凋亡，从
25、而达到保护缺血心肌，减少心肌有效工作细胞的进一步丢失，改善心功能的目的。除此之外，法舒地尔亦可能是通过抑制神经内分泌激活及强力抗氧化作用，增加内皮型一氧化氮合成酶(eNOS) 的表达，促进一氧化氮生成，减轻细胞内钙超载，减少心肌细胞凋亡诱导因素对心肌的影响，起到心肌保护作用。目前，法舒地尔主要用于蛛网膜下隙出血术后脑血管痉挛、脑缺血等的防治。近年来，随着其药理作用及临床应用研究的不断深入，法舒地尔被越来越多地应用于心血管领域，并取得了大量成果，有望成为防治心血管疾病的新的治疗药物。 【参考文献】 1BALDI A, ABBATE A, BUSSANI R, et al. Apoptosis a
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