1、非甾醇类抗炎药物对晶状体抗氧化酶失活的保护作用【关键词】 阿斯匹林 关键词: 阿斯匹林;布洛芬;扑热息痛;超氧化物歧化酶;过氧化氢酶;糖基化 摘 要:目的 研究非甾醇类抗炎药物对抗氧化酶失活的作用. 方法 以超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）分别与糖加阿斯匹林、布洛芬和扑热息痛孵育，于相应的孵育时间采用分光光度计测定酶的活性. 结果 糖与酶的孵育导致时间依赖性的 SOD 和 CAT 失活.果糖表现出比 6-磷酸葡萄糖（G6P）和葡萄糖更快速的失活效应.酶孵育 6d 后，20mmolL-1 阿斯匹林可部分保护 50mmolL-1 果糖和G6P 诱导 SOD 的失活，5mmolL-1
2、G6P 和 10mmolL-1 葡萄糖诱导 CAT 的失活，未观察到保护 5mmolL-1 果糖诱导 CAT 的失活.而布洛芬有限地保护糖基化诱导 CAT 的失活，对 SOD 的失活无保护作用.扑热息痛对两者均无保护作用. 结论 阿斯匹林和布洛芬可部分保护糖基化诱导 CAT 和 SOD 的失活.这可能在阿斯匹林类药物抑制白内障发病的作用机制中起重要作用. Keywords:aspirin;ibuprofen;paracetomal;superoxide dis-mutase;catalase;glycation Abstract:AIM To evaluate the protection o
3、f nonsteroidal anti-inflammatory drugs against inactivation of antioxidant enzymes.METHODS The superoxide dimutase（SOD）and catalase（CAT）were incubated with sugar or with aspirin，ibuprofen and paracetamol，respectively.The enzyme activi-ties were assayed by the spectrophotometer and expressed relative
4、 to the control activity at each respective incubation time.RESULTS Fructose，glucose6-phosphate（G6P）and glucose inactivated the SOD and CAT in a time-dependant manner.Fructose displayed a more rapid inactivation effect than G6P and glucose.After incubation6days，20mmolL-1 aspirin partially protected
5、SOD against inactivation by50mmolL-1 fructose and G6P and also protected CAT against inactivation by5mmolL-1 G6P and10mmolL-1 glu-cose.No protection was observed against inactivation of CAT by fructose.Ibuprofen showed a limited protection CAT against inactivation by fructose，G6P and glucose but not
6、 SOD.Paracetamol offered no protection SOD and CAT a-gainst glycation-induced inactivation.CONCLUSION As-pirin and ibuprofen show partial protection against the glyca-tion-induced inactivation of SOD and CAT.This may play an important role in preventing cataract by aspirin-like anal-gesics. 0 引言 阿斯匹
7、林（aspirin，Asp） 、布洛芬（ibuprofen，Ibu）和扑热息痛（paracetamol，Para）是非甾醇类药物，作为解热镇痛、消炎、抗风湿以及预防心肌梗死和血栓形成，已广泛地应用于临床.1981 年从临床流行病调查中偶然发现阿斯匹林有预防和治疗白内障的作用，大量的临床流行病和实验研究表明，低剂量口服阿斯匹林可延缓白内障的发病，但是其确切的作用机制尚不清楚1，2 .晶状体抗氧化防御系统的损害是白内障形成的重要原因，大多数白内障药物治疗就基于此理论.超氧化物歧化酶（superoxide dimutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是晶状体抗氧化酶系统中主要的
8、组成成分，本研究通过观察阿斯匹林类药物对糖基化诱导晶状体抗氧化酶 SOD 和 CAT 失活的作用，探讨其防治白内障的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 牛红细胞 SOD（EC1.15.1.1） 、牛肝脏 CAT（EC1.11.1.6） 、果糖、6-磷酸葡萄糖（G6P） 、葡萄糖、Asp，Ibu 和 Para 等均为美国Sigma 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 酶孵育和活性测定3SOD:SOD（220IU，50g）溶解于0.12molL-1 磷酸钠缓冲液（含 10-4 molL-1 EDTA，pH7.8）分别与 50mmolL-1 果糖、G6P 和葡萄糖混合并通过 0.2m 微孔过
9、滤器，分装于消毒小玻璃瓶，37水孵箱振动孵育，孵育第 0，3，6 和 8 日，每份孵育液进行透析（4） ，24h 换 3 次蒸馏水.通过 550nm 日本产 Hitach2000 分光光度计检测马心脏细胞色素 C 与黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应的下降率，表示 SOD 的酶活性.CAT:CAT（525IU，25g）溶解于 50mmolL-1 磷酸钠缓冲液（pH7.0） ，分别与 5mmolL-1 果糖、G6P 和 10mmolL-1 葡萄糖混合并通过 0.2m 微孔过滤器，分装于消毒小玻璃瓶，37水孵箱振动孵育.孵育 0，1，2，4，6 和 8d，通过检测 25下，1min 内240nm 光吸收过氧
10、化氢分解的下降率来测定 CAT 活性. 1.2.2 阿斯匹林类药物与酶的孵育 10 或 20mmolL-1 的Asp，Ibu 和 Para 分别与 SOD，加或不加 50mmolL-1 果糖、G6P和葡萄糖，水振动孵育 8d;与 CAT 混合后，加或不加 5mmolL-1 果糖、G6P 和 10mmolL-1 葡萄糖，水振动孵育 6d，分别检测酶活性. 统计学处理:采用与正常对照的百分比来表示酶活性.所有统计结果均采用 Student t 检验. 2 结果 20mmolL-1 Asp 与 SOD 孵育 6d 后可保护果糖和 G6P 诱导SOD 的失活（Tab1）.孵育 8d 内 10mmolL
11、-1 Asp 组与无 Asp 组比较差异均无显著性. 表 1 Asp 对糖基化诱导 SOD 失活的保护作用 略 表 2 Asp 和 Ibu 对糖基化诱导 CAT 失活的保护作用 略 3 讨论 白内障的致病因素是多元性的，氧化损害已被认为在与老化相关的各类疾病，包括白内障、黄斑变性和糖尿病等发病过程中起重要作用2，4，5 .抗氧化防御系统包括酶和非酶两个过程.晶状体内含有多种防止自由基和氧损害的酶，其中主要的抗氧化酶是谷胱甘肽过氧化物酶、SOD 和 CAT2，4 .SOD 可将超氧自由基转变为过氧化物，并被CAT 和谷胱甘肽过氧化物酶清除6 .CAT 和 SOD 活性下降，是老年性白内障重要的发
12、病原因之一2，5-7 .本实验结果提示，糖与 SOD 和CAT 孵育可导致酶活性下降.糖基化诱导的 SOD 和 CAT 的失活表现为时间依赖效应，与酶糖基化的化学性修饰程度相一致.提示正常生理状态下，低浓度的糖可能糖基化晶状体的代谢酶而导致其生理特性的变化.在 SOD反应中可能是组氨酸/赖氨酸基团被修饰8 .该病理过程参与糖尿病并发症和老化等病理过程.果糖较其他糖对酶的损伤更严重.大量酶学研究表明，糖基化程度的顺序为核糖果糖G6P葡萄糖9 . 阿斯匹林亦称乙酰水杨酸（acetylsalicylic acid）在临床应用甚广.来自英国、德国、美国和印度具有代表性的临床流行病学研究表明，坚持服用
13、Asp，可防止造成视力损害的后囊下和混合性白内障.Asp 可抑制糖基化反应，阻断晶体蛋白的氨基酸基团乙酰化反应以及继发的巯基丧失和晶体蛋白的凝聚，减少晶体蛋白的非二硫交联反应的产物，阻止丙二醛反应.同时可抑制环氧化物酶和降低血糖，增加血流量.Asp 可保护糖基化诱导的苹果酸盐脱氢酶和谷胱甘肽还原酶的失活，抑制大鼠糖尿病性白内障的发生1，2 .本实验结果表明 Asp 可部分保护果糖和 G6P诱导 SOD 的失活，G6P 和葡萄糖诱导 CAT 的失活，这种作用可能是通过氨基乙酰化酶的赖氨酸基团，竞争了糖基化的结合位点而保护酶的活性. Asp 对果糖诱导 CAT 的失活无保护作用，可能因为果糖的酶失
14、活效应非常明显，使 Asp 无足够的时间通过乙酰化作用抑制糖基化反应.相反，Ibu 对此有保护作用.在英国牛津眼科医院实验室的研究中，我们也发现Ibu 主要的两种代谢产物可保护果糖诱导酯酶的失活，但其本身却无此作用.它可能是通过其代谢产物来保护酶的活性.Ibu 和 Asp 可能存在不同的保护机制. 有关 Para 亦称对乙酰氨基酚（acetaminophen） 的研究资料较少，Para 的乙酰基团被认为是不可折叠，尽管去乙酰化合物和氨苯化合物是主要的代谢产物，但它对减少葡萄糖胺结合晶状体蛋白作用比 Ibu 还小.它对糖基化诱导的 SOD 和 CAT 失活无保护作用，可能与其无乙酰化作用以及与酶
15、结合量小有关2 .本实验提示 Asp 和 Ibu 可抑制非酶促的糖基化反应，保护晶状体的主要的抗氧化酶，稳定其抗氧化防御系统，从而延缓或阻止晶状体蛋白的氧化损伤，维持晶状体的透明.进一步研究阿斯匹林类药物在防治白内障中的作用机制，可为其潜在的临床应用提供实验依据. 致 谢 英国牛津大学眼科医院 Harding 教授对本研究给予指导和帮助. 参考文献: 1Yan H，Zhang DG，Yang XG.The effects of aspirin-like drugs on prevention of cataract J.Chin J Pract Ophthalmol，1999;17（10）:5
16、82-583. 2Harding JJ.Cataract:Biochemistry，epidemiology and pharma-cology M.1st ed.London:ChapmanHall，1991:219-249. 3Yan H，Harding JJ.Glycation-induced inactivation and loss of antigenicity of catalase and superoxide dismutase J.Biochem J，1997;328（8）:599-605. 4Delcourt C，Cristol JP，Leger CL，Descomps
17、B，Papoz L.As-sociations of antioxidant enzymes wih cataract and age-related macular degeneration J.Ophthalmology，1999;106（3）:215-221. 5Babizhayev MA.Failure to withstand oxidative stress induced by phospholipid hydroperoxides as a possible cause of the lens opacities in systemic diseases and ageing
18、J.Biochim Biophys Acta，1996;1315（2）:87-99. 6Rypniewski WR，Mangani S，Bruni B，Orioli PL，Casati M，Wilson KS.Crystal structure of reduced bovine erythrocyte su-peroxide dismutase at1.9A resolution J.J Mol Biol，1995;251（4）:282-296. 7Giblin FJ，Schrimscher L，Reddan JR，Reddy VN.The relative roles of catalas
19、e and the glutathione redox cycle in detoxification of H2 O2 by the lens J.Invest Ophthal Vis Sci，1987;28（suppl）:190. 8Adachi T，Ohta H，Hirano K，Hayashi K，Marklund SL.Non-enzymic glycation of human extracellular superoxide dismutase J.Biochem J，1991;279（5）:263-267. 9Hook DWA， Harding JJ.Protection of enzymes by-crystallin acting as a molecular chaperone J.Int J Biol Macromol，1998;22（3）:295-306.
