1、高血压疾病时血液系统 L精氨酸载体转运动力学的改变作者：王军 徐洪涛 姚兴海 臧益民 唐朝枢 【关键词】 高血压 关键词: 高血压;红细胞;血小板;L-精氨酸 摘 要:目的 探讨原发性高血压（EH）时人体血液系统 L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）载体转运功能的改变. 方法 EH 患者 12 例及健康成年人 16 例，提取血小板（Pt）和红细胞（RBC） ，分别测定 Pt 和 RBC的 L-Arg 转运的动力学特征. 结果 EH 患者 Pt 和 RBC 对 3 H-L-Arg 转运呈高亲和性载体转运方式，在不同浓度点 EH 患者的 3 H-L-Arg 转运率均比对照组明显低下（P0
2、.01）.Eadie-Hofstee Plot 分析，EH 患者 Pt L-Arg 的最大转运速率（V max ）为对照组的 79%（P0.05） ，而 Pt3 H-L-Arg 转运的米氏常数值（Km ）无明显差异.RBC 的 L-Arg 转运总能力 Y+ 载体转运系统的转运能力明显低于正常组（P0.01） ，而 Y+ L 载体转运系统的转运能力无明显改变.L-Arg 总转运的最大速率与 Y+ 载体转运系统的最大速率分别较对照组降低 36.8%和 42.5%（P0.01） ，各组之间 Km 无明显差异. 结论 EH 患者 Pt 和 RBC L-Arg 载体转运系统存在明显异常. Keyword
3、s:hypertension;erythrocyte;platelet;L-arginine Abstract:AIM To investigate the changes of L-arginine （L-Arg）transportation kinetic characteristics in erythrocytes（RBC）and platelets（pt） of patients with essential hyperten-sion（EH）.METHODS 12EH patients were studied with16normotensive people as contro
4、l.The RBC and Pt were prepared and the transportation of L-Arg was measured by using the method described by Ghigo and Deliconstantins.RESULTS In EH patients，the ability of Pt L-Arg trans-portation was lower than control and Vmax decreased by21%（P0.01）.In RBC，Saturable influx of L-Arg was mediated b
5、y teh classical cationic amino acid transport system Y+ and Y+ L system with high affinity.Under zero-trans condition，the ability of L-Arg transportation in EH patients was lower than control.The Vmax for total L-Arg transport and via sys-tem Y+ decreased36.8%and42.5%respectively compared with contr
6、ol（P0.01）.But Vmax for L-Arg transport via system Y+ L was not affected by EH.There was no obvious difference between the groups.CONCLUSION There might be disturbance of L-Arg transportation in human erythrocytes and platelets of patients with EH. 0 引言 高血压病是人类死亡的重要原因之一，其发病机制仍未完全阐明.高血压时血液系统功能的改变尤其血小板
7、（Pt）与红细胞（RBC）功能的变化及由此而引起的血液动力学指标的异常是其重要并发症.血细胞功能改变在血栓形成和动脉粥样硬化及高血压发病过程中的作用逐渐受到人们的重视.研究1，2 表明 Pt 与 RBC 内均存在 L-精氨酸（L-Arg）载体转运系统，通过合成的一氧化氮（NO）来调节 Pt 和 RBC 的各种生理功能.我们观察了血细胞 L-Arg 载体转运系统的改变及其动力学特征，以探讨 L-Arg 载体转运系统在高血压发病学上的意义. 1 材料和方法 1.1 病例选择与分组 原发性高血压（EH）X 期患者 12（男 8，女4）例，平均年龄（48.89.2）岁，符合高血压诊断标准，平均收缩压（
8、21.172.57）kPa，平均舒张压（13.592.24）kPa，平均动脉压（15.013.96）kPa.正常对照组 16 例，平均年龄（46.311.5）岁，常规体格检查均正常.检查前 2wk 停药.L2，3-3 HArginine（19.6104 mol-1 ）购自 Amer-sham Co，其余药品均购自 Sigma，为分析纯试剂. 1.2 富 Pt 血浆（PRP）制备 静脉取血，加入 38gL-1 枸橼酸钠抗凝， （血与抗凝剂体积比为 91） ，离心制备 PRP，用 Hepes 液将Pt 数调整在 2010 L-1 25106 L-1 . 1.3 RBC 提取3 采用 Delicon
9、stantions G 的方法并加以改良.晨起抽取肘静脉血，肝素抗凝，在 4 倍体积的洗涤液（NaCl140，KCl5，D-glucose5，Mops10mmolL-1 ）中洗涤 RBC3次（4离心，3000rmin-1 ，10min） ，弃上清及上方 15%的细胞，再洗涤 3 次，将其悬浮于改良的 Hanks 平衡盐溶液中并记数. 1.4 Pt 的 LArg 转运4 测定 按 110（V/V）取 PRP 于不含CaCl2 和葡萄糖的 Hepes 液中，4，2350rmin 离心 10min，弃上清，重复洗脱 1 次.用含 CaCl2 和葡萄糖的 Hepes 液将 Pt 数调整至5105 L-
10、1 .取 50L 分别加入不同浓度的 3 H-L-Arg， （5，10，20，40，80，100 和 200molL-1 ）孵育 1min，加入终止液（Formal dehyed270，EGTA16，Nacl150mmolL-1 ）100L.经 0.45m 孔径微孔滤膜抽滤，用 Hepes 液 4mL 冲洗 3 次，滤膜吹干加入闪烁液，在液闪仪上测 3 H-L-Arg 放射活性，同时设立不加样本的非特异平行对照管，L-Arg 的 Pt 转运为总摄入量与非特异结合之差.以 pmol10-5 Pt 表示. 1.5 RBC 的 LArg 转运5，6 将 RBC 在无底物的条件下 37孵育 3h.用选
11、择性 Y+ 阻断剂 NEM（N-ethylmaleimide）与 RBC 悬液在25反应 15min，停止反应，洗涤后作转运测定用.3 HL-Arg 转运测定，取 RBC 悬液 1mL（1105 个细胞）分别加入 5molL-1 500molL-1 的3 HL-Arg，37孵育 5min，冰上停止反应，用冷的等张溶液洗涤细胞后将细胞溶解后测定细胞悬液的蛋白含量.3HL-Arg 转运率采用微孔滤膜抽滤法测定.用 NEM 处理过的 RBC 的3 HL-Arg 转运是由 Y+ L 系统介导的;由 Y+ 系统介导的 3 HL-Arg 转运用 NEM 未处理过的 RBC 的3 HL-Arg 总转运率减去
12、 Y+ L 系统的转运率. 统计学处理:实验结果以 x s 表示，方差分析组间 q 检验作统计学处理. 2 结果 2.1 EH 患者 Pt LArg 转运动力学指标的变化 EH 患者及对照组 L-Arg 转运的浓度曲线见 Fig1. Pt 对 3 H-L-Arg 转运呈高亲和载体转运方式，在不同浓度点 EH 患者的转运率均比对照组明显低下，P0.01.Eadie-Hofstee Plot 分析，EH 患者 Pt L-Arg 的最大转运速率（Vmax ）对照组为 79%（P0.05） ，而 Pt3 H-L-Arg 转运的米氏常数值（Km ）无明显差异（P0.05）. 图 1 略 2.2 EH 患
13、者 RBC LArg 转运动力学的变化 EH 患者 RBC Y+ 系统和Y+ L 系统对 L-Arg 的转运方式与 Pt 相似，亦呈高亲和转运方式（Fig2，3）.在不同浓度点 EH 患者 RBC L-Arg 的总转运速率和通过 Y+ 系统介导的转运速率均明显低于对照组，各点差异均十分显著（P0.01）.而由 Y+ L 系统介导的转运速率在各浓度点均与对照组无明显差异（P0.05）.EH 患者 RBC L-Arg 的总转运最大速率 Vmax ，Y+ 系统介导的转运最大速率分别较对照组降低36.8%（3.330.28vs5.270.40，P0.01）和42.5%（2.500.21vs4.350.
14、32，P0.01）.而各转运系统 L-Arg 转运的 Km 无明显差异（P0.05）. 3 讨论 多数学者认为高血压时血液在血管内呈湍流状态，此时细胞与细胞之间、细胞与血管壁之间相互碰撞，使血小板膜受损，引起 ADP 释放，从而使血小板黏附与聚集功能大为增加.已有实验证实，血小板通过高亲和性非 Na+ 依赖性 Y+ 蛋白氨基酸载体转运 L-Arg 到细胞，在 NO 合酶的作用下生成 NO，NO 通过激活鸟苷酸环化酶，使胞质内 Ca2+ 下降，从而抑制血小板的黏附与聚集.另有报道高血压时血小板 NO 合成减少，其减少是否与载体功能有关尚未见报道. 本实验证实高血压时，确存在 Pt 聚集功能的增强
15、且可能与 L-Arg 转运功能的降低及 NO 生成减少有关.故本文提示，在治疗高血压时，除积极降压外，还需考虑与抑制血小板活性的药物及促进血小板 L-Arg 转运的药物联合应用，对防治动脉粥样硬化和减少并发症可能会有更好的疗效. 图 2 图 3 略 1994 年有人用电子自旋共振法（electron spin resonance，ESR）证实了 RBC 能够合成 NO 以调节自身的生理功能5 .而 NO 合成的前体L-Arg 是由 RBC 膜上的氨基酸转运载体系统 Y+ 系统和 Y+ L 系统转运入细胞的.RBC 自身产生的 NO 可能参与调节 RBC 的变形能力、膜渗透脆性，维持细胞膜骨架的
16、稳定，影响 RBC 的膜渗透脆性，并与血液循环及血压的调节和氧的运输与释放有关7，8 .最近资料表明 RBC 尚有维持血管张力和调节 Pt 功能的作用，预先用 NOS 抑制剂处理 RBC，则由 RBC 介导的抑制 Pt 黏附与聚集的作用会明显降低，提示 RBC 的这种调节作用至少部分是通过 NO 来实现的9 .疾病时 RBC L-Arg 转运功能及 NO 的生成已有报道.慢性肾衰尿毒症患者 RBC L-Arg 转运功能明显增加，其中 Y+ 系统的转运能力升高明显，而 Y+ L 系统的功能改变不明显7 ，提示Y+ L 系统主要参加生理条件的 L-Arg 转运.而这种改变可能是尿毒症患者的血浆 L
17、-Arg 较低的一种代偿反应.Dario 等 10 发现疟疾患者 RBC 的 NOS 活性及 NO 产生量较正常人明显升高.而在乳腺癌患者由于 RBC NOS 活性的升高、NO 及 ONOO- 释放增加，使 RBC膜硬度增加，降低了 RBC 寿命，导致患者出现贫血的并发症8 . 关于高血压时 RBC L-Arg 转运的改变目前尚无报道.由本文结果可见，高血压时 RBC L-Arg 转运能力明显减低，尤以 Y+ 系统与 L-Arg 转运能力减低有关. 参考文献: 1Zicha J，Kunes J，Devynck MA.Platelet calcium handling is dif-ferent
18、 in rats with salt-dependent and spontaneoes forms of ge-netic hypertension J.Am J Hypertens，1996;9:812-814. 2Mendes AC， Hanssen H，Kiessling K.Transport of L-arg and the nitric oxide inhibitor N 8 -monomethyl L-arg in human ery-throcytes in chronic renal failure J.Clin Sci，1997;93:57-63. 3Deliconsta
19、ntions G，Villiotou V，Stavrides JC.Nitric oxide and peroxynitrite production by human erythrocytes:A causative factor of toxic anemia in breast cancer patients J.Anticancer Res，1995;15:1435-1446. 4Ding Ah，Nathan CF，Stuehr DJ.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates
20、 from mouse peritondal macorphages J.J Immunol，1988;141:2407. 5Hiroaki K， Satonorl T，Tadashi Y.Direct proof of nitric oxide formation from a nitrovascular metabolised by erythrocytes J.Biochem Biophy Res Com，1994;3:1055-1061. 6Deves R，Angelo S，Chavez P.N-Ethylmaleimide discriminates between two lysi
21、ne transport system in human erythrocyte J.J Physiol，1993;468:753-766. 7Mendes AC， Hanssen H，Kiessling K.Transport of L-arg and the nitric oxide inhibitor Hg-monomethyl-L-arg in human ery-throcytes in chronic renal failure J.Clin Sci，1997;93:57-64. 8George D，Vassiliki V，John C.Nitric oxide and perox
22、ynitrire production by human erythrocytes:A causative factor of toxic anemia in breast cancer patients J.Anticancer Res，1995;15:1435-1446. 9Hadengue AI，Delpiro M，Simon A.Evidence for the presence of L-arginine-nitric oxide pathway in human red blood cells:Rele-vance in the effects of red blood cell on platelet function J.Hypertension，1998;32（2）:324-332. 10Dario G，Roberta T，Hagai G.Erythrocyte stage of plasmodium falciparum exhibit a high nitric oxide synthase activity and re-lease a NOS-inducing soluble factor J.J Exp Med，1995;182:677-688.
