1、肝癌中基质金属蛋白酶及其抑制因子的研究进展【摘要】 基质金属蛋白酶(MMP)家族是降解细胞外基质的重要酶类，组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)是 MMP 的天然抑制物。在细胞外基质中MMPs 和 TIMPs 的失衡已证实与多种病理状态,尤其是与肿瘤的侵袭和转移密切相关。作者就 MMP 和 TIMP 的结构、功能及其与肝癌(HCC)侵袭、转移的研究进展进行综述。 【关键词】 基质金属蛋白酶; 基质金属蛋白酶组织抑制因子; 肝癌; 综述Abstract The matrix metalloproteinase(MMP) family is an important enzyme degrading
2、 extracellular matrix, and the tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP) is a natural inhibitor of MMP. The imbalance of MMPs and TIMPs in the extracellular matrix has confirmed to relate with a variety of pathological states, especially tumor invasions and metastasis. Here, a review concerning ab
3、out the research proceeding of the structures and functions of MMPs and TIMPs, the relationship between them and hepatocellular carcinoma(HCC) invasion or metastasis is presented.Key words matrix metalloproteinase; the tissue inhibitor of metalloproteinase; hepatocellular carcinoma; review肿瘤的侵袭与转移是恶
4、性肿瘤重要的生物学特征，是一个多步骤的复杂过程。目前研究表明，肿瘤的侵袭和转移都需要借助于蛋白酶的表达与激活1。基质金属蛋白酶(MMPs)是人体内降解细胞外基质(ECM)的主要酶类，参与肿瘤演变的众多生理和病理过程。MMPs 的活性受内源性组织抑制因子(TIMPs)调节。TIMPs 通过与 MMPs 结合形成复合体，有效终止 MMP 家族成员的水解活性。对 MMPs 的深入研究，将有助于对恶性肿瘤侵袭、转移机制的进一步认识，从而为肿瘤转移治疗提供方向。作者就肝癌中 MMPs 及 TIMPs 的研究进展进行简要综述。1 MMPs1.1 MMPs 的结构MMPs 是一类具有 Zn2+依赖性的内源性
5、蛋白水解酶,几乎能降解除多糖外 ECM 的所有成分。自 1962 年 Gross 等人首先发现第一种间质胶原酶并命名为 MMP1 ，至今在 MMP 家族中至少已发现 26 个成员2。所有成员至少有以下 6 个共同点：(1) 均含有 Zn2+中心;(2) 通常在中性条件下发挥活性，有 Ca2+参与时活性最大;(3) 其结构具有高度的恒定性;(4) 均以酶原形式分泌;(5) 均能水解至少一种 ECM 成分;(6) 其活性均可被TIMPs 所抑制，每种 MMP 至少被一种 TIMPs 抑制3。1.2 MMPs 的分类MMPs 具有高度的同源性，按作用底物不同主要可将其大致分为以下几类：(1) 胶原酶
6、，包括 MMP1 、8 、13 ，主要降解和型胶原;(2) 基质酶(间质溶素)，包括 MMP3 、10 、11 ，主要降解、型胶原和基质中的蛋白多糖、糖蛋白;(3) 明胶酶，包括明胶酶 A(MMP2)和明胶酶 B(MMP9) ，主要降解型胶原纤维和层粘连蛋白;(4) 膜类基质金属蛋白酶(MTMMP) ，包括MMP14 、15 、16 、17 、24 、25 ，这种酶表达于细胞表面，除能降解 ECM 外，对 MMP2 和 MMP13 有激活作用;(5) 弹性蛋白酶(MMP12);(6) 其它,包括 MMP19 、20 、23 、26 。1.3 MMPs 的调控正常生理条件下，MMPs 的活性很低
7、并受控于 3 个因素：(1) 基因转录;(2) MMPs 前肽(酶原)的激活;(3) TIMPs 的调节。MMPs 的生物合成由其基因转录率所决定。而 MMPs 的基因转录受许多因素的影响,如MMP9 的 1562 位存在 C 到 T 的突变时可影响 MMP9 基因的表达水平4。其中，生长因子和细胞因子等活性介质是酶原合成阶段最主要的调节因素，它们不仅能促进或抑制 MMPs mRNA 的转录，而且能影响其半衰期;另外，一些黏附分子(受体)、TPA 等致癌剂以及细胞外环境等因素均对MMPs 的转录有调控作用。MMPs 的活性抑制可发生在两个层次上：一是在前肽转化为活性形态时;二是其活体与 TIM
8、Ps 结合而被抑制。MMPs 与TIMPs 的平衡程度决定了净 MMPs 活性，同时也是决定 ECM 转化的重要因素，其在组织重建、血管生成、伤口愈合、胚胎发育、肿瘤细胞的侵袭转移等过程中发挥重要作用5。1.4 MMPs 在肿瘤发生和转移中的作用MMPs 对肿瘤的影响机制可能有：(1) 破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障。MMPs 可以通过分解 ECM 成分使其降解成小的孔隙，破坏 ECM 的完整性，从而使肿瘤细胞可以通过这些孔隙扩散而促进肿瘤的侵袭转移6。(2) 促进新生血管形成。肿瘤细胞除自身分泌 MMPs 外，还通过分泌促血管生成因子，间接促进血管内皮细胞产生 MMPs，降解基底膜(BM)和
9、ECM成分，进而促进肿瘤新生血管的生成。MMPs 在血管形成的基底膜降解、细胞运动和管腔形成等过程中起重要作用，还可提高促血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子 2(TGF2)及转化生长因子 2(TGF2)的作用。Fang 等7研究证实在肿瘤结节内新生血管形成的早期，MMP2 有重要的作用。MMP2外源性抑制物或反义核酸均能导致肿瘤蛋白水解能力及血管新生能力的丧失。有报道表明 MMP7 可剂量依赖性地加速体外内皮细胞增生，并促进内皮细胞分泌 MMP1 和 MMP2 来溶解血管周围的基底膜和(或)连接组织8。(3) 调节细胞黏附。肿瘤细胞要成
10、功地完成移动过程，必须具有黏附和脱黏附的能力。Deryugina 等9研究证实，膜型基质金属蛋白酶 1(MT1MMP) 能活化整合素 ，进而增强玻璃粘连蛋白介导的乳腺癌 MCF7 细胞株的黏附与移行，同时共表达 MT1MMP 。与整合素 结合的 MCF7 细胞株能最有效地与 MMP2 的 C 末端结合并活化MMP2 ，进一步证实 MMPs 与 TIMPs 在肿瘤转移过程中具有调节细胞黏附的重要作用。(4) 激活具有潜在活性的蛋白质。研究表明，MMPs 能激活两类具有潜在活性的蛋白质，即血浆纤维蛋白原和层粘连蛋白5 。Folkman 等10分离得到了一种具有很强的抗血管增生活性的蛋白质血管抑制素
11、(angiostatin)，这种蛋白质为由原位增殖性肿瘤分泌的具有抑制肿瘤转移和生长能力的因子。测序表明，血管抑制素是无蛋白水解活性的血浆纤维蛋白原的一个片段。随后证实，MMP3 、7 、9 、12 都可使血浆纤维蛋白原降解为血管抑制素的类似片段。2 TIMPs2.1 TIMPs 的一般生物学特性TIMPs 是一组很早就被发现的糖蛋白，广泛分布于组织和体液中，可由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等产生。TIMPs 是组织中 MMPs 主要的内源性抑制因子，能特异地抑制 MMPs 家族的基质降解酶。TIMPs 与MMPs 的亲和力不同，但皆以可逆的非共价的形式按 11 的比例结合到MMPs 的活性
12、位点。己发现的 TIMPs 有 4 种，分别命名为TIMP1 、2 、3 、4 。在肝脏中只发现 TIMP1 和 TIMP2 的表达。TIMPs 的结构具有一定的同源性,有两个功能区:氨基末端功能区相对保守,为与 MMPs Zn2+活性中心结合的区域;羧基末端功能区，在 TIMPs 定位和(或)与前酶型 MMPs 形成复合物方面有重要意义。2.2 TIMPs 的分布及功能TIMP1( 相对分子质量 28 000)在体内分布最广，能被多种细胞因子诱导产生，可与所有 MMPs 结合，尤其是MMP1 、2 、3 、7 、9;TIMP2( 相对分子质量 21 000)多随MMP2 的表达而表达，很少受
13、细胞因子的诱导，可与 MMP1 、2 、3呈 11 结合;TIMP3( 相对分子质量 24 000)最初是从 SV240 转化的鸡胚纤维细胞中分离出来的，仅存在于 ECM 中。TIMP4( 相对分子质量 22 600)在 ECM 的组织特异性调节循环中起着很重要的作用。TIMPs 是多功能分子，不仅抑制 MMPs 的活性，且具有细胞生长因子样作用，促进成纤维细胞(成肌纤维细胞)增生及胶原合成，使 ECM 沉积并抑制其降解11。TIMPs 可调控 ECM 代谢和抑制血管的生成，还可抑制肿瘤细胞的发生、侵袭和转移。TIMP1 和 TIMP2 能刺激多种细胞增殖并且抑制活化的肝星状细胞(HSC)凋亡
14、。TIMPs 调节肿瘤细胞与基质的相互作用，在肝癌侵袭过程中扮演十分重要的角色，TIMP1 可能是肝癌肺转移的标志6，TIMP2 与肝癌预后显著相关12-13。3 MMPs/TIMPs 与肝癌3.1 在肝癌中的表达对 MMPs/TIMPs 在肝癌中的表达情况仍有争议。有报道称，在肝细胞癌中 MMPs 表达为阴性，而 TIMPs 在肝细胞癌(HCC)中表达同样明显减少甚至为阴性14。但谢玉梅等15研究发现,正常肝组织和肝转移的高分化腺癌组织中无 TIMP1 、2 表达,而 HCC 无论是癌组织还是癌旁组织二者均有表达,阳性信号分布在胞浆内,且 TIMP1 的表达强于TIMP2 。Lichting
15、hagen 等16报道，正常肝细胞中有MMP1 、2 、3 、9 、11 的表达，但未检测到 MMP7 。HCC 中MMPs 表达类型与正常肝区别不大，但在表达量上存在不同，MMP3 、MMP10 、MMP2 、MMP9 、MMP1 表达增强，MMP11 无改变。此外，Sakamoto 等17报道小肝癌细胞 MMP9 出现过量表达，但蔡阳等18研究发现 HCC 组织中 MMP9 表达与肿瘤大小、病理分化无关，正常肝、HCC 及癌旁组织均有 MMP9 mRNA 表达，而在 19.1% HCC 病例癌旁组织 MMP9 mRNA 的表达与癌组织相等或反而增高。另有报道成纤维细胞中高表达的 MMP1
16、与肝癌的恶性预后有关13。3.2 参与肝癌的侵袭、转移肿瘤侵袭转移必须首先去除基底膜的机械屏障，MMPs 在此过程中起重要作用1。胡劲松等19研究发现肝癌细胞中高表达 MMP9 ，低表达 TIMP2 ，这可能是肝癌细胞侵袭、转移的主要基础。而 MMP2 并无重要作用，与肝癌预后关系不密切。Kuyvenhoven 等20用 ELISA 法检测了 91 例肝病患者血浆 MMP2 和 MMP9 水平,与正常对照相比,MMP2 含量在慢性肝病和肝癌中明显升高,并随 ChildPugh 分级增加而增高。由于慢性肝病和肝癌患者血浆 MMP2 的水平相似,故认为不能将其作为诊断标志物。但刘玮等21研究显示
17、MMP2 在 HCC 组织中表达上调，且与肿瘤大小、分化程度、静脉浸润、TNM 分期相关，提示 MMP2 阳性表达者预后不良。近期，陈连周等22发现 MMP9 在 HCC 癌组织和癌旁组织中的表达阳性率高于正常肝组织，但 TIMP2 在 HCC 癌组织中表达阳性率低于癌旁组织和正常肝组织，而且 TIMP2 表达随癌的转移而降低。而 Altadill 等13新近研究表明基质细胞中高表达的 TIMP2 与肝癌侵袭转移相关，这可能因为 TIMPs 是多功能蛋白质，除可抑制 MMPs 外，还可以直接促进肿瘤转移23。3.3 在肝癌治疗中的临床意义在肝癌的治疗中，手术切除被认为是首选的方法。肝癌的病死率
18、很高，术后转移和复发是影响患者术后长期生存的首要原因。对 MMPs 的研究有助于了解肝癌的侵袭转移机制。Mckenna 等24研究了 MMPs 及TIMPs 在肝癌输出淋巴结中的表达情况，发现除淋巴细胞持续高表达的TIMP1 无明显变化外，MMP2 、7 、9 及 TIMP2 mRNA 在 HCC 输出淋巴结中的表达量均显著增加。而且 MMPs 与 TIMPs 的增加比率不同，这可能与微小转移瘤自身在输出淋巴结中的表达及肿瘤、周边基质细胞和多种细胞因子刺激 MMPs 的表达有关。输出淋巴结在肿瘤侵袭转移中起重要作用，因此可用输出淋巴结中 MMPs 和 TIMPs mRNA 的表达情况反映肿瘤的
19、整体特征。Cheng 等25在探索加强放射促进 HCC 侵袭的分子机制时发现，加强放射治疗可使 MMP9 mRNA、蛋白水平及活性上调，而MMP9 反义核苷酸可抑制这种上调进而阻止加强放射治疗导致的 HCC 侵袭。随后进一步研究发现加强放射治疗可通过 PI3K/Akt/NFB 信号转导通路，而不是 AP1 通路增加 MMP9 的活性从而加速 HCC 的侵袭。毕明俊等26观察原发性肝癌患者射频消融术(RFA)治疗前后血浆MMPs(MMP1 、7 、9 、13) 的浓度改变，发现 HCC 患者血浆MMP1 、9 、13 的浓度明显高于正常值范围，RFA 治疗后其浓度暂时性升高，然后下降至较低水平。
20、因此，MMP1 、9 、13 可作为肝癌患者诊断和 RFA 疗效判断指标。Zhang 等27发现结合 TNM 分期，MMP2 、MMP9 可以很好地预测 HCC 患者肝移植后的预后27。3.4 在肝癌治疗中的临床应用以上大量研究表明,MMPs 和 TIMPs 在肝癌中起重要作用。而 MMPs和 TIMPs 的作用是复杂的平衡体系,在疾病状态下会发生改变,可能成为新的治疗靶标。在各种癌症模型中给予合成的 TIMPs,通过细胞凋亡或血管生成抑制机制,减少原发性肿瘤生长及癌转移,这些已有临床前研究数据证实。目前人们研究的抗肿瘤侵袭和转移的治疗方法主要有以下几个方面：(1) MMPs 抑制因子的应用,
21、包括巴马司他、普马司他、马马司他和美他司他等。初步结果表明,它们不仅能抑制 ECM 降解,还显示出抑制新生血管形成的作用28。(2) 反义核苷酸及 RNA 干扰技术，RNA 干扰技术是近年来发展起来的研究基因功能的新工具。Lakka 等29实验证明,利用反义核酸技术可以降低 MMP9 的表达,减少肿瘤细胞的侵袭力。利用反义技术及 RNA 干扰可以改变和抑制肿瘤生物学行为,是肿瘤治疗的新方向。(3) 基因治疗，在动物模型体内进行 TIMPs 的转基因治疗发现其具有抗肿瘤的作用30,肿瘤基因治疗是一种新的方法。4 展 望研究 MMPs 与 TIMPs 在肝癌中的诊断价值，对于判断预后及治疗具有重要
22、的意义。在肿瘤的发生发展过程中，MMPs 的表达均增高，其过度表达与淋巴结转移及预后不良有关31，可以通过对肿瘤及癌旁组织中的 MMPs/TIMPs 的测量来判断患者的预后。在肿瘤的治疗方面，人工合成的 TIMPs 已进入临床试验阶段，有关资料显示，该类生物制剂是非细胞毒性的，能明显抑制体内肿瘤的生长、浸润和转移，从而有效地预防肿瘤的复发。与细胞毒性药物的联合使用能明显提高患者生存率。因此，自 20 世纪 90 年代以来，MMPs 及 TIMPs 一直是肿瘤研究领域的一个热点。研究 MMPs/TIMPs 及其与各种细胞因子之间的相互作用，必将在分子基因水平上有进一步的认识，指导我们的临床工作，
23、也为抗肿瘤转移治疗提供了一个重要靶点。但仍存在以下问题：(1) MMPs 家族各个成员的结构以及功能有待进一步了解;(2) HCC 不同发展阶段各型 MMPs 表达情况的相关研究不多;(3) MMPs 与 TIMPs 相互作用的调控机制不甚明了;(4) 特异性强、毒副作用低的 TIMPs 有待进一步研发。深入研究 MMPs 和 TIMPs 的作用不仅有助于对肝癌侵袭转移的认识，同时也为肝癌的治疗提供了一个极有希望的发展方向。【参考文献】1 DERYUGINA E I, QUIGLEY J P. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis J.
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