1、骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展及中药干预的前景展望作者：冼绍祥， 汪朝晖， 杨忠奇，李南夷， 赵立诚 【关键词】 骨髓祖代细胞；,心肌细胞；,综述,指导性 摘要：综述了骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的生物学特征，体外培养诱导 MSCs 分化成为心肌细胞，体内心肌微环境诱导 MSCs 生成心肌细胞及中药在 MSCs 诱导分化上的突破等研究概况。认为中药在 MSCs 诱导分化上的突破是国内外学者为修复坏死的心肌组织而进行对 MSCs 诱导分化为心肌细胞的有益尝试。以抗肿瘤药物 5 氮胞苷作为诱导剂对 MSCs 进行诱导，诱导分化率不高，且有
2、一定的局限性；根据中医药在防治心脑血管疾病方面取得较好的疗效，及不少研究表明中药或其有效成分能有效地诱导 MSCs 分化为神经元细胞，并且其诱导率比传统西医学方法高，展望中药有可能诱导 MSCs 分化为心肌细胞。采用中药有效成分作为诱导剂对 MSCs 进行诱导分化，这不仅为应用中医药治疗心肌梗塞提供新的理论依据，而且有可能与细胞移植的方法相结合治疗某些心血管疾病，可作为现代治疗方法的补充手段，为临床研究带来广阔的应用前景。 关键词：骨髓祖代细胞； 心肌细胞； 综述，指导性 心肌梗塞后存活的心肌减少、继发心室重构，是造成心肌梗塞患者发生心力衰竭(心衰)、心律失常甚至死亡的重要原因。心肌细胞不能再
3、生，损害的心肌细胞不能修复和分化，故临床中西药物治疗、介入治疗和手术治疗都很难取效，而心脏移植由于手术复杂、供体困难和费用高等原因，在临床很难推广。因此，寻找可代替死亡细胞的移植物来防治心肌梗塞后的心衰、心肌重构，改善心功能，是近年来研究的热点。 近年的研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的特点，在一定的环境和刺激因子作用下可分化为组织细胞，如成肌细胞（包括心肌细胞） 、骨细胞、软骨细胞、神经细胞及脂肪细胞等1 ，且在体外培养的过程中能始终保持其多向分化潜能。在组织工程中，MSCs 作为一种重要的种子细胞越来越
4、引起人们的关注。将 MSCs 诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织，具有一定的临床意义。本文就目前体内外诱导 MSCs 成为心肌细胞的研究状况进行综述，并对中医药在此领域的应用前景作一展望。 1 MSCs 的生物学特征 MSCs 属于非造血细胞，其基本特点是贴壁生长，呈纺锤状的纤维细胞样形态，具有巨大的培养增殖潜力和独特的细胞表型，并呈现为表面抗体 SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124 和CD166 阳性，CD14、CD34、CD45 阴性12 。MSCs 在培养过程中经过连续多代培养，仍能维持正常染色质组成及端粒活性，因而具有很大的体
5、外培养扩增能力。Reyes 等3研究认为 MSCs 具有独特的表型和巨大的培养增殖能力，细胞可以扩增到 1570 倍细胞周期； Guo 等4的研究提示多种细胞因子如肿瘤坏死因子 （TNF） ，干扰素 （INF） ，干细胞因子（SCF）及胰岛素样生长因子 1（IGF1）能明显促进 MSCs 增殖；细胞化学结果显示，几乎所有 MSCs 呈萘酚醋酸酯酶（ANAE）及糖原（PAS）反应阳性，而呈酸性磷酸酶（ACP）及苏丹黑（SB）反应阴性。Biano 等5采用体外培养和体内移植发现骨髓间充质细胞的存在；他们在体外培养 MSCs 时发现，在低密度培养时，每个细胞很快贴壁生长并形成克隆的、非巨噬细胞性的、
6、成纤维细胞样的细胞系，在合适的实验条件下可分化为多种结缔组织，如骨、软骨、脂肪组织、纤维组织和骨髓支持基质等；体内移植实验发现一部分克隆细胞系可以完全建立骨髓间充质，形成骨细胞、骨髓支持基质和脂肪细胞，说明 MSCs 是多向分化潜能的干细胞而非定向分化的祖细胞6-10 。Weissman11认为 MSCs不但能大量增殖，而且在一定条件下可以分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、神经和造血微环境组织等，表明 MSCs 有很高的可塑性。 2 体外培养诱导 MSCs 分化为心肌细胞 1995 年 Wakitani 等12在体外培养中将骨髓间充质细胞经 2 次细胞传代后，以 5 氮胞苷进行?24?h?诱导，于
7、711?d?后得到长的多核肌管，而且此肌管对骨骼肌细胞特异性肌球蛋白单克隆抗体染色为阳性，从而确定 MSCs 可以于体外诱导成为骨骼肌细胞。在此基础上，Makino 等13及 Fukuda14最早用大鼠 MSCs 在体外连续传代培养，暴露于 5氮胞苷中，结果成功地诱导出心肌细胞。在小鼠胚胎细胞系向心肌细胞分化的研究中，Konieczny 等15提出，这类细胞含有肌细胞源性决定族，在甲基化状态呈现转录失活，而在 5 氮胞苷作用下，即去甲基状态下，肌细胞决定族转录激活，从而使该类细胞分化为心肌细胞。 3 体内心肌微环境下诱导 MSCs 分化为心肌细胞 Kenneth16将 MSCs 注入羊胚胎腹腔
8、中，MSCs 因迁移的部位不同而分化为软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞、骨髓支持基质和胸腺基质，证明 MSCs 具有在体内不同的微环境中可以被诱导生成多种不同细胞的能力，其中包括形成新生心肌细胞的能力。 Tomita 等17在成年大鼠体内进行诱导 MSCs 分化成心肌细胞的研究：将从骨髓分离出来的新鲜 MSCs 经过培养和 5 氮胞苷处理，注射到自体心肌疤痕组织内，8 周后可见心肌样细胞形成，具有肌钙蛋白 T 和肌球蛋白重链染色阳性的心肌细胞特异性标志。Wang 等18用 MSCs 进行体内心肌细胞移植分化实验研究，以检测骨髓细胞植入心肌后，能否进行环境依赖性发育并能体内分化心肌细胞。他们
9、将 MSCs 不经过 5 氮胞苷处理即注射到大鼠自体心脏，发现 MSCs 可以被诱导为新的心肌细胞，其形态学与正常心肌细胞相似，形成细胞核位于中央的肌小节，并与宿主细胞一样显示出清晰的横纹。此肌小节呈肌球蛋白重链染色阳性，证明为新生心肌细胞；此后 Wang 等19采用同样的方法培养 MSCs，经冠状动脉注入左冠状动脉结扎 2 周后的心脏模型中，MSCs 可以被迁移出冠状动脉系统而于心脏模型中成活，但与 Tomita 的实验结果不同的是，注入的MSCs 因生存的微环境不同而被诱导成心肌细胞和成纤维母细胞。Strauer等20首先描述了对一位急性心肌梗塞患者进行干细胞治疗的结果：46 岁男性病人在
10、胸痛?14?h?后行经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)和支架植入术，?6?d?后将分离出的 12107 自体骨髓单核细胞经过导管低压输入梗死的相关动脉，首次从临床上证实选择性冠状动脉内输入自体骨髓细胞可以改善心脏功能和减少心肌梗塞的范围，于坏死心肌疤痕内发现有新的心肌细胞再生。2003 年，Perin 等21报道借助 NOGA 心内检测系统经过心内膜对 14 例因严重心肌缺血导致心力衰竭患者进行自体 MSCs移植治疗，4 个月的随访发现患者心功能有较好的改善。 4 中药在 MSCs 诱导分化上的突破 中医药在防治心脑血管疾病方面取得了较好的疗效，近 2 年来，不少研究机构证明某些中药单体、中药
11、或中成药能有效地诱导 MSCs 分化为神经元细胞，并且其诱导率比传统西医学方法高，这些研究为应用中药防治神经系统疾病提供了坚实的理论基础。 肖庆忠等22观察麝香多肽在大鼠体外定向诱导 MSCs 时，发现加入麝香多肽后，MSCs 胞体收缩，突起伸出，形态类似神经元；免疫组化显示神经元特异性烯醇酶（NES）和巢蛋白（nestin）呈阳性，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阴性，提示麝香多肽能诱导 MSCs 分化为神经元样细胞。刘金保等23采用黄芪、天麻、人参、当归、脑舒新和人参蜂王浆在体外定向诱导 MSCs?13?h?后，大部分细胞出现胞体和突起，免疫细胞化学染色结果：神经元特异性 NES 和 nest
12、in 呈阳性，GFAP 呈阴性，提示以上中药均能诱导 MSCs 分化为神经元样细胞。陈东风等24采用药物血清学方法，应用龟板含药血清体外诱导大鼠 MSCs 分化为神经元样细胞。 中药诱导 MSCs 分化为神经元细胞的具体机理还不清楚，但多数研究者认为其机理可能同中药抗氧化和抗损伤作用有关，并且都有诱导分化率高、安全性和长期有效性好的显著优点2224 。应用中药成功诱导MSCs 分化为神经元样细胞的研究结果提示我们，在理论上可以相信某些中药有可能诱导 MSCs 分化为心肌细胞。 5 中药治疗冠心病心肌梗塞的实验研究 目前国内外对中药能否诱导 MSCs 分化为心肌细胞的研究还没有报道，所开展的实验
13、研究是在众多治疗冠心病的中药中，筛选临床上常用治疗冠心病的药物如三七、黄芪、人参、红花的有效成分来进行研究。三七总皂甙（PNP） 、黄芪皂甙（AS） 、人参总皂甙（GS）和红花黄色素（SY）分别是它们的有效成分，现代中药药理研究表明，它们都具有抗心肌缺血和预防心肌再灌注损伤等作用。 陈锋等25对大鼠进行心肌缺血再灌注造模，长时间三七总皂甙处理可促进热休克蛋白（HSP70）的表达，增加蛋白激酶的含量（PKC） ，减少再灌注损伤中的钙超载，对心肌再灌注损伤有良好的保护作用。张腾等26应用异丙肾上腺素（ISOP）复制心肌缺血模型，发现三七总皂甙能使心肌超微结构病理改变明显减轻，采用光电镜技术和基因表
14、达芯片技术，从分子学角度发现三七总皂甙能显著减轻 ISOP 所致的大鼠心肌缺血病理损伤程度；在基因表达谱的研究中，发现三七总皂甙可能通过多途径对基因的表达进行调控，从而发挥其显著抗心肌缺血损伤的作用。唐旭东等27从分子水平探讨心肌缺血再灌注损伤的发生机制及三七总皂甙对心肌保护的机理，在三七总皂甙处理组中，三七总皂甙能抑制核因子 KB 的活化及中性粒细胞细胞间粘附分子 1（ICAM1）的表达和中性粒细胞心肌浸润而起到保护心肌的作用。 李靖等28在采用缺氧复氧的方法造成的心肌细胞损伤模型中，加入黄芪皂甙后发现，损伤的心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放明显受到抑制；孙成文等29用黄嘌呤黄嘌呤氧化酶（
15、XXOD）诱发超氧阴离子自由基，复制大鼠实验性损伤模型，可见到黄芪皂甙能显著改善XXOD 致损大鼠的心肌收缩性能，表明黄芪皂甙具有抗氧化损伤作用。 侯明晓等30观察到在心肌缺血再灌注损伤模型中，人参总皂甙能防止心肌细胞线粒体膜磷脂降解，保护钙活性，可防止细胞内钙超负荷，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。陈图刚等31从细胞分子水平探讨了人参总皂甙对心肌细胞凋亡的抑制作用，发现人参总皂甙能显著减少心肌细胞凋亡，经人参总皂甙干预的受损心肌细胞，其存活率呈剂量依赖性提高，而细胞凋亡百分率呈剂量依赖性减少。 朴永哲等32用 ISOP 造成大鼠心肌缺血模型后，发现红花黄色素能缓解大鼠导联心电图上 J/R 的改变
16、，从而缓解 ISOP 诱发的缺血缺氧性心肌损伤，并能缓解线粒体肿胀、线粒体膜流动性下降及超微结构损伤，因而能改善心肌能量代谢，缓解心肌缺氧缺血。 6 存在的问题和中药干预的研究前景 现代医学对 MSCs 诱导分化为心肌细胞的研究虽取得了一定的进展，但是单纯的 MSCs 在体移植，在体内很容易被扩散或蛋白酶水解，能到达缺血坏死心肌的 MSCs 不多，其分化成熟的心肌细胞数目更少，实际应用受限；而体外诱导分化则是在抗肿瘤制剂 5 氮胞苷的条件下实现，其心肌细胞的分化率也很低，而且其临床安全性和长期有效性还难以实现，因此有必要进一步筛选对 MSCs 诱导分化率高、临床应用安全且有效的药物。 由于 M
17、SCs 的可塑性大，在某种条件下可以分化为包括心肌细胞在内的多种功能细胞，而应用中药成功诱导 MSCs 分化为神经元样细胞的研究结果提示我们，在理论上可以相信某些中药有可能诱导 MSCs 分化为心肌细胞。 进行中药诱导 MSCs 分化为心肌细胞的探索，将为应用中医药治疗心肌梗塞提供新的理论依据。中药具有临床应用安全和长期有效性的特点，能扩张冠状动脉，抗心肌缺血；能调节机体免疫，抗排斥反应；能促进细胞增殖，抗细胞凋亡；能增强基因调控，促蛋白表达等。中药的以上作用可以克服目前现代医学研究中存在的某些困境，因此中药有可能与细胞移植的方法相结合治疗冠心病心肌梗塞、心力衰竭、难治性心肌病。中医药疗法作为
18、现代治疗方法的补充手段，可弥补当前之不足，同时也可与基因工程、组织工程相结合为中医治疗心血管病提供新的理论基础，并为临床研究带来广阔的应用前景。故积极开展中药诱导 MSCs 分化为心肌细胞的研究并与干细胞移植结合起来，有可能成为中医药走向现代化的一个切入点，具有重大的实际意义。 参考文献： 1Pittenger M F，Mackay A M，Beck S C，et al.Multilinage potential of adult human mesenchymal stem cells J.Sciences，1999，284(5411):143. 2Conget P A， Mingguell
19、 J J.Phenotypical and functional properties of human bone mesenchymal progenitor cellsJ.J Cell Physiol，1999，181:67. 3Reyes M，Verfaillie C M.Characterization of multipotent adult progenitor cells，a subpopulation of mesenchymal stem cellsJ.Ann New York Acad Sci，2001，938:231. 4Guo Z K，Yang J Q，Liu X D，
20、et al. Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrowJ. Chin Med J，2001，114:950. 5Biano P，Riminucci M，Gronthos，et al. Bone marrow stromal stem cells: nature，biology，and potential applicationsJ. Stem Cells，2001，19(3):180. 6Prockop D J. Marrow stromal cells as stem cells for nonh
21、ematopoietic tissuesJ. Sicience，1997，276:71. 7Muraglia A，Cancedda R，Quarto R.Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical modelJ.J Cell Sci，2000，113(Pt7):1161. 8Krause D S，Theise N D，Collector M I，et al.Multiorgan，multilineage engraftment b
22、y a single bone marrowderived stem cellJ.Cell，2001，105:369. 9Conget P A，Allers C，Minguell J J. Identification of a discrete population of human bone marrowderived mesenchymal cells exhibiting properties of uncommitted progenitorsJ.J Hematother Stem Cell Res，2001，10:749. 10Minguell J J，Erices A，Conge
23、t P. Mesenchymal stem cellsJ.Exp Biol Med(Maywood)，2001，226:597. 11 Weissman I L. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic:barriers and opportunitiesJ.Science，2000，287:1442. 12Wakitani S，Tomoyuki Saito，Arnoldi Caplan，et al. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal st
24、em cells exposed to 5azacytidineJ. Muscle Nerve，1995，18:1417. 13Makino S，Fukuda K，Miyoshi S，et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitroJ.J Clin Invest，1999，103 (5):697. 14Fukuda F. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular
25、tissue engineeringJ. Artificial Organs，2001，25(3):187. 15Konieczny S F，Emerson C P.5azacytidine induction of stable mesodermal stem cells lineages from 10T1/2 cells: evidence for regulatory genes controlling determinationJ.Cell，1984，38:791. 16Kenneth W L，Tippi C M，Aimen F S，et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate sitespecific
