1、黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究作者：杨倩春，杨霓芝，陈伯钧，雷娓娓，王桦，马红岩 【关键词】 黄芪 摘要：【目的】观察黄芪注射液对大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型的治疗作用。 【方法】SD 大鼠 48 只，除 12 只作空白对照组外，其他大鼠均在慢性肾炎模型的基础上加造气虚血瘀证模型后，随机分为模型组、黄芪高剂量组(8g/kg)和黄芪低剂量组(4g/kg)，每组 12 只；给药 4 周后，检测模型大鼠的一般状态、肾功能、细胞免疫功能及肾组织病理学改变，进行组间疗效比较。 【结果】黄芪高、低剂量组对模型大鼠的一般状态、生化指标及肾组织的病理损害均有改善作用，并呈现出剂量效应关系。【
2、结论】黄芪注射液能提高慢性肾炎气虚血瘀证大鼠的细胞免疫功能，改善血凝状态，减轻肾组织病理损害，有防治慢性肾炎的作用。 关键词：黄芪注射液/药理学；肾小球肾炎/中药疗法；肾小球肾炎/免疫学；肾小球肾炎/病理学；气虚血瘀；疾病模型，动物；大鼠 应用具有益气作用的黄芪注射液治疗慢性肾小球肾炎病人，临床已取得一定的疗效。在此基础上，我们观察了黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证模型的作用，现报告如下。 1 材料与方法 11 动物 健康低龄(3 周)雄性 SD 大鼠(体质量约 100g)4 只，雄性新西兰兔 8只，雄性 SD 大鼠 48 只(200250g)，均由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠合格证号：
3、2002A004；新西兰兔合格证号：2001A067。 12 试剂与仪器 兔抗鼠 Thy1 抗血清(AST)自备；完全弗氏佐剂由 Sigma 公司提供；抗兔 IgG 荧光抗体，由天象人公司提供；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠 IgG 由 Sigma 公司提供；亿鸣-200 病理图像分析仪，由广州亿鸣科技有限公司提供。 13 药物 黄芪注射液每 10mL 含原生药 20g，由成都地奥九泓制药厂生产，生产批号：0305061。 14 分组 雄性 SD 大鼠 48 只，随机分为 4 组，每组 12 只：模型组(A 组)、黄芪高剂量组(B 组)、黄芪低剂量组(C 组)、空白对照组(D 组)。
4、 15 大鼠慢性肾炎模型的制备 抗 Thy1 系膜增殖性肾炎模型的建立参照文献 ，步骤如下： 151 免疫 New Zealand(NZ)白兔 低龄 SD 雄性大鼠 4 只，麻醉后取胸腺，剪碎并挤出胸腺细胞，经200 目尼龙网过滤除去混杂的组织，滤液为淋巴细胞悬液，以等体积生理盐水和完全弗氏佐剂稀释至 1，注射至兔背部皮下，每只个胸腺细胞；第 2、4 周时分别静脉注射个胸腺细胞，强化免疫。 152 测定抗血清效价 第 2 次静脉注射胸腺细胞后第 3 天，从兔耳缘静脉取血 2mL，测定血清抗胸腺细胞抗体的效价。方法如下：分离大鼠胸腺细胞，用生理盐水稀释至，取 1 滴细胞悬液滴于干净玻片，吹干，用
5、体积分数为 95%的酒精固定 5min，吹干；将正常 NZ 白兔血清、抗血清原液及其 110、120、140、180 及 1160 的稀释液各 80L 滴加在胸腺细胞涂片上，均匀散开；37孵育 40min 后用磷酸盐缓冲液(PBS)(001mol/L,pH74)冲洗；加抗兔荧光抗体(效价 110)，37孵育40min，PBS 冲洗；当效价大于 180(即 180 的稀释液仍有较强的染色)时将兔放血，离心后，将血清保存于-40。 153 提纯血清 兔抗血清用饱和硫酸铵法提纯，抗血清(体积设为 mL)中加入等体积的 PBS(001mol/L,pH 74)及 2 倍体积的饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，在
6、4旋转 30min 后，以 60009000r/min 离心 15min，去上清(为白蛋白部分)，沉淀溶于 PBS 中，再加入 2mL 饱和硫酸铵溶液，4旋转30min，60009000r/min 离心 15min，沉淀继续溶于 PBS 中，如上重复3 次。最后将沉淀溶于少量 PBS 中，在 4透析 24h，用钠氏试剂检测无铵离子时即得粗制的抗体 IgG，经测定蛋白浓度后，于-20保存。 154 大鼠抗 Thy1 抗体肾炎模型的制作 空白对照组尾静脉注射生理盐水 20mL/kg；其余各组均于实验当日腹腔麻醉后由尾静脉注射 AST 10mL/kg 和正常兔血清 10mL/kg。 16 大鼠气虚血
7、瘀模型的建立 参考文献方法，在实验第 2 周时，对各组大鼠行游泳疲劳试验，连续 2 周。 17 给药剂量及途径 给药剂量参考文献 。在首次注射 AST 后的第 2 天开始，模型组予以生理盐水 10mLkgd，高剂量组予以黄芪注射液 8gkgd，低剂量组予以黄芪注射液4gkgd，均尾静脉注射；空白对照组不施加任何处理因素，自由饮食。全部大鼠于造模后第 2 周末及第 4 周末用代谢笼收集 24h 尿液，并于第 4 周末行眼球摘除采血后，处死取肾组织。 18 观察指标 181 一般状况 观察造模后各组大鼠的精神状态、体质量、体毛、饲料量、大小便及活动情况等。 182 24h 尿蛋白定量 分别在第 2
8、 周末及第 4 周末用代谢笼分批收集各组大鼠的 24h 尿液，用磺基水杨酸比浊法进行测定。 183 尿纤维蛋白降解产物(FDP)测定 用乳胶定性法进行测定。 184 血清尿素氮、肌酐测定 采用电极法。 185 淋巴细胞亚群测定 采用 T 淋巴细胞 AMAE 复合物染色对比法 ，计数 100 个淋巴细胞。 186 肾组织学检查 括免疫荧光检查、光学显微镜和电子显微镜观察。 1861 免疫荧光学检查 取小块肾皮质组织作冰冻切片，用 FITC 标记的兔抗大鼠 IgG(效价164)作直接荧光染色，AO onetwenty 荧光显微镜观察。荧光强度分级标准参照文献：“-”：未见荧光；“”：低倍镜下不显现
9、，高倍镜下似乎可见；“+”：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见；“+”：低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见；“+”：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；“+”：低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。 1862 光学显微镜观察 取部分肾组织用体积分数为 10%的中性甲醛固定，阶梯乙醚脱水，石蜡包埋，切片，苏木素伊红染色(HE)和过碘酸雪夫氏反应染色(PAS)，光学显微镜下进行观察、拍照；每例标本任选 10 个肾小球，采用病理图像分析仪计算每个肾小球内的系膜细胞数，测量每个肾小球的直径，并作统计分析。 1863 电子显微镜观察 每组 3 只大鼠分别选取 1mm大小肾组织 3 块作电镜观察，常规用20g/L 戊二醛前固定
10、，10g/L 锇酸后固定，阶梯乙醇脱水，环氧树脂 EPN 812 包埋，超薄切片，并行铀和铅双重染色后，置 JEM-1200 EX 电子显微镜下观察超微结构。 19 统计学处理 计量资料采用 t 检验；分类资料采用 检验。 2 结果 21 一般情况 在实验过程中模型组有 1 例大鼠死亡。造模之后各组大鼠均出现不同程度的精神不振、摄食减少、生长迟缓、身体消瘦、蜷缩、体毛无光泽、大便稀烂等现象，尤以模型组最为显著。 22 24h 尿蛋白定量测定 结果见表 1。表 1 黄芪注射液对 24h 尿蛋白定量的影响（略） 23 血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)测定 结果见表 2。表 2 黄芪注射液对血清
11、 BUN、SCr 含量的影响（略） 24 淋巴细胞亚群测定 结果见表 3。表 3 黄芪注射液对 T 淋巴细胞亚群的影响（略） 25 尿 FDP 定性测定 模型组大鼠尿 FDP 检测全部阳性，阳性率为 100%；黄芪高剂量组 4例阳性，阳性率 333%；黄芪低剂量组 5 例阳性，阳性率 417%；高、低剂量组与模型组比较均有显著性差异(005)。 26 肾组织学检查 261 免疫荧光检查 结果见表 4。表 4 黄芪注射液对大鼠肾皮质免疫荧光强度的影响（略） 262 光镜检查 空白对照组肾小球结构正常(图 1a)；模型组肾小球增大，肾小球内系膜细胞数增多，可见少量炎性细胞浸润，毛细血管管腔受压，肾
12、小球囊腔狭窄，近曲小管上皮细胞呈轻度或中度水肿(图 1b)；黄芪高、低剂量组与模型组比较，系膜细胞增多现象均有减轻，炎性细胞浸润消失，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转(图 1c、d)。对每例标本任选 10 个肾小球，采用病理图像分析仪计数每个肾小球内的系膜细胞数，测量每个肾小球的直径，以及从肾小球极到血管极的长度，结果见表 5。表 5 黄芪注射液对肾小球内细胞数、肾小球大小的影响（略） 263 电镜检查 空白对照组细胞结构完整(图 2a，图 3a)；模型组系膜细胞增多，系膜区基质增生，系膜区增宽，有云雾状致密物在系膜区沉积，基底膜稍增厚，毛细血管管腔轻、中度变窄，毛细血管内皮细胞轻度或中度肿胀(
13、图 2b，图 3b)；黄芪高剂量组与模型组比较，系膜细胞增生情况减轻，基底膜恢复正常，系膜区增宽情况减轻，足细胞的足突未融合，毛细血管管腔病变情况消除，毛细血管内皮细胞无肿胀(图 2c，图 3c)；黄芪低剂量组与模型组比较，病理改变均轻于模型组，但重于黄芪高剂量组(图2d，图 3d)。 3 讨论 31 模型的选择、制备及评价 根据国内 1 397 例慢性肾衰的资料分析，在引起终末期肾衰的各种病因中，慢性肾炎占首位，达 6419% 。而系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是我国原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，据统计约占我国肾穿刺病人的 50%左右 。1997 年世界卫生组织(WHO)肾病委员会
14、正式把 MsPGN 作为肾小球肾炎中一个独立类型，以持续性蛋白尿和血尿为特征，它的主要病理变化是肾小球系膜细胞增殖和细胞基质增多，可导致肾小球纤维化和肾小球硬化 。 慢性肾炎属于中医学的“水肿” 、 “腰痛”等范畴，后期可属“虚劳”范畴，其发病多为本虚标实。慢性肾炎病程长，久病不愈，导致正气虚弱，其中以肺、脾、肾三脏亏虚为主。肺主一身正气；脾为后天之本、气血生化之源，主运化；肾为先天之本，主水液。肺虚不能通调水道，水液内停；脾虚则运化失司，湿浊内生；肾虚则气化功能失常，内生水湿，均导致气血运行不畅，血行迟滞而成瘀；气为血帅，气行则血行，气虚无力推动血液运行，阻滞而成瘀。有研究认为气虚血行不畅导
15、致瘀血，虚与瘀均贯穿疾病的始终 ，慢性肾炎的发病过程中气虚血瘀型所占比例约 563% 。 本实验选择陈氏 Thy1 大鼠肾炎模型，其特点是：该模型接近人体慢性肾炎病变；采用抗胸腺细胞血清法诱发大鼠系膜增殖性肾炎，方法简单，模型成功率高，可达 100% 。该模型病变明显，且能较长时间持续存在，首次注射 Thy1 抗血清后，每周 1 次，连续 4 次 ，模型在实验周期内更加稳定。我们在大鼠肾炎造模过程中，进行了大鼠游泳疲劳试验，复制出慢性肾炎气虚血瘀证模型，因此本实验的动物模型既具有中医肾“病”的特征，同时又具有中医“证”的特征。造模过程中大鼠出现了精神不振，摄食减少，生长迟缓，身体消瘦等症状，与
16、气虚症状相吻合。T 淋巴细胞亚群检测提示模型组大鼠 CD、CD降低，CD增高，导致 CD与 CD比值降低，表明机体存在细胞免疫功能紊乱；造模大鼠出现尿纤维蛋白降解产物增多，表明本实验大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型造模成功。 32 黄芪的作用机理 黄芪注射液是从中药黄芪中提取而成，富含多种氨基酸和微量元素等，有益气健脾、利水消肿的作用 。动物实验表明其具有扩张血管，降低血压，抗血小板凝集，增加肾血流量，改善肾脏微循环和消除过氧化脂质作用 。黄芪还能抗氧化自由基，降低自由基生长，促进自由基消除，从而保护肾组织细胞 。 本研究结果表明，黄芪能降低 24h 尿蛋白含量，降低血清 BUN、SCr的水平，并呈
17、现良好的剂量效应关系；能提高细胞免疫功能，降低尿 FDP水平。黄芪高、低剂量组与模型组比较，系膜细胞增生现象均有减轻，炎性细胞浸润消失，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转；基底膜恢复正常，系膜区未见增宽，毛细血管腔受压情况消除，内皮细胞肿胀情况减轻。本研究提示：黄芪注射液能减少尿蛋白、改善肾功能、提高细胞免疫功能、降低尿 FDP，减轻肾组织病理改变，从而达到防治慢性肾炎的目的。 参考文献： 陈广平大鼠 Thy1 抗血清制备及系膜增殖性肾炎模型建立 临床与实验病理杂志，1996，12(3)：12 李仪奎中药药理实验方法学 上海：上海科学技术出版社，19939 Quesada.T 淋巴细胞 AMAE
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