1、化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异的研究【摘要】 目的观察化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞的保护作用，以及其药理作用与动物灌胃给药的量-时效关系。方法以化浊行血汤不同给药方案、药后不同取血时间所得的药物血清为受试对象，培养血管内皮细胞，进行缺氧复氧实验，复氧同时给予不同化浊行血汤含药血清干预，采用 MTT 法观察不同含药血清对缺氧内皮细胞活性的影响。结果含药血清各组与模型组比较有显著差异(P0.05)。给药后不同时间取血所获得的药物血清对缺氧内皮细胞活力的影响存在一定差异，以2 次/d 灌胃连续 3 d，并在末次灌胃 90 min 后取血所得药物血清药理效应最佳。结论化浊行
2、血汤含药血清具有保护缺氧内皮细胞的作用，其血清药效与动物给药方法存在一定时效关系。 【关键词】 化浊行血汤； 内皮细胞； 血清药理学； MTT 法中药复方进入体内后，不同剂量的药物其在体内的吸收、分布、代谢、排泄不同，血药浓度达峰时间和起效时间亦有较大差异。为研究中药复方化浊行血汤对内皮缺氧损伤的保护作用，本实验采用 MTT 法观察化浊行血汤含药血清对内皮细胞抗缺氧能力的影响，并据此筛选出合适的含药血清浓度用于后续内皮缺氧损伤的研究。1 材料与仪器1.1 对象雄性 Sprague-dawley 大鼠，体质量（25020）g，购于山东中医药大学动物中心，符合国家二级实验动物标准；人脐静脉内皮细胞
3、系（hUVECs，购自山东省医学科学院，自美国组织培养库ATTCCCRI1998 引进） 。1.2 试剂 1640 培养基（GIBCO 公司产品） 、胎牛血清（FBS，Hyclone 公司产品） ；四氮唑蓝(美国 SIGMA)；二甲基亚砜(北京世纪银丰科技有限公司)。1.3 仪器 JJT-1300 超净工作台（北京半导体设备一厂） ；5%CO2恒温培养箱（Forma Scientific 公司） ；倒置相差显微镜（美国 AO Sientific Instrument；酶标仪） ；EL340I 全自动酶标仪（美国 Biotok公司产品） 。2 方法2.1 药物的配制和含药血清的制备化浊行血汤由荷
4、叶、焦山楂、决明子、赤芍、酒大黄、路路通、虎杖、何首乌，制水蛭粉组成（全部药材来源于山东中医药大学附属医院） ，为水煎醇沉工艺制作浸膏，4贮存备用。取 SD 大鼠按 8.25 g/kg 灌服化浊行血汤。中药 A 组大鼠按照每日灌胃两次连续 3 d，中药 B 组大鼠按照灌胃 1 次/d，连续 5 d，空白组灌服等量生理盐水，末次给药前禁食 12 h，给药后 30，60，90，150 min 腹主动脉取血，分离血清并灭活、过滤除菌，置20保存备用。2.2 内皮细胞体外缺血、缺氧模型的建立和实验分组选择生长良好的内皮细胞，以 5104/ml 密度接种于 96 孔板，培养 24 h 后，分为正常对照组
5、、模型组及药物（缺氧）各剂量组进行缺血、缺氧造模及干预。 正常组：换 1640 培养基（1640 90%，正常大鼠血清 10%） ，并始终在正常条件下培养。模型组：以 2006 年叶武等1报告的方法稍加改进。缺氧时先将缺氧罐（由干燥皿改装）提前 10 min 充入氮气（流速 4.5 Lmin） ，以保证缺氧罐内气体的纯度，罐周边封凡士林密闭，然后置于 37生化培养箱中，备用。将培养板中内皮细胞换缺氧无血清1640 培养基（用前预先向培养基通入氮气 3 min） ；将其放入缺氧罐内。缺氧 6h 后，将培养液换为含 10正常大鼠血清的 1640 培养液，置于培养箱中（空气+5%CO2）继续培养 1
6、8 h，然后进行检测。中药各剂量组：造模同模型组，缺氧 6 h 后，将培养液换成含 10SD 大鼠药物血清的1640 培养液，置于培养箱中（空气+5% CO2）继续培养 18 h，然后进行检测。2.3 四氮唑蓝(MTT)检测各组内皮细胞两次，各加入 1640 100 l，MTT 15 l，继续置培养箱中孵育 4 h。吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 l，终止反应。振荡器振荡 10 min，全自动酶标仪 490 nm 波长，空白孔调零，测定各孔吸光度（OD）值。2.4 统计学处理使用 SPSS10.0 软件进行统计。组内差异采用 t检验，组间差异采用多因素方差分析，F 检验(A
7、von)。3 结果3.1 各组内皮细胞形态特征变化镜下观察正常组内皮细胞展开贴壁，形态无明显改变。体外模拟缺氧 6 h 后模型组内皮细胞回缩，间隙变大，变圆细胞增多，常规培养 18 h 后大量内皮细胞变圆并呈团漂浮，折光性增强。中剂量中药各组镜下观察缺氧并经含药血清干预后也可见细胞回缩，部分细胞变圆并漂浮；但各组仍见贴壁的内皮细胞数量明显多于模型组，漂浮变圆细胞明显少于模型组。3.2 各组内皮细胞缺血缺氧后细胞活力的比较（MTT 实验）结果见表 1。表 1 10化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞 MTT 比色实验的影响（略）4 讨论4.1 化浊行血汤含药血清的对缺氧复氧内皮细胞的保护作用王新陆教
8、授根据多年的临床经验，以“血浊”立论，创立清化血浊法治疗中风，并据此组方化浊行血汤。化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、制水蛭、酒军、路路通、虎杖、何首乌组成。动物实验研究表明，化浊行血汤能明显改善 MCAO 大鼠缺血再灌注后的神经功能损伤、减小缺血再灌注脑损伤的体积，该治疗作用与其对脑血管内皮细胞、神经细胞的保护作用有关。本实验建立血管内皮细胞缺血再灌注模型，利用化浊行血汤含药血清进行干预，以 MTT 评价内皮细胞缺氧损伤变化。MTT 在活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶作用下还原成一种蓝紫色结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，在一定细胞数范围内，MTT 结晶物形成的量与活细胞数量成正
9、比。实验研究证明缺氧复氧后内皮细胞活力明显下降并伴有显著地形态学异常，而化浊行血汤含药血清能显著提高缺氧复氧后内皮细胞的活力且形态学改变较小。提示该方具有明显的血管内皮细胞保护作用。4.2 化浊行血汤含药血清药效与动物体内给药有一定的时效关系中药血清药理学研究表明，含药血清的时效主要与动物的给药时间和取血时间有关。由于不同中药复方成分很大差别，给药后的峰值出现的时间亦有较大差别。血清中确切的药效成分并不清楚时，应利用药效为指标行“时效关系”研究，以评判最佳给药时间和取血时间。严格地说，应该根据药物半衰期给药，连续 57 个半衰期达到稳态血药浓度，但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，我们
10、按照化浊行血汤为半衰期 12 h 设定每日灌胃两次连续 3 d 给药方案 A，按照化浊行血汤为半衰期 12 h 设定每日灌胃 1 次连续 6 d 给药方案 B，结果表明两种方案获得含药血清无明显差别。如果对药物血清时效关系进行研究，应另当别论。实验动物学研究表明，大鼠一般灌喂给药后 12 h 后血药浓度达到峰值，此时的血清为机体功能状态血清，最好能通过预实验来确定最佳血时间，我们在本研究中设立了灌喂后 30，60，90，150 min 4 个采血时间点。结果表明，化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用与大鼠取血时间有一定的时效关系，给药后药效逐渐增强，灌喂后 90 min 药效最明显，150 mim 时药效已有下降的趋势，提示灌喂后 90 min 所得含药血清药物浓度最高，具有最佳的药理效果。总之，我们的研究表明，化浊行血汤含药血清对缺氧血管内皮细胞的具有明显保护作用，且该药理作用与动物灌喂后的采血时间有一定时效关系，据此我们认为按照每日灌胃 2 次，连续 3 d 给药并在末次灌喂后 90 min 采血获得含药血清具有最明显的内皮保护作用，这为我们后续的深入研究打下了基础。【参考文献】1叶武，毛威，华军益，等.阿托伐他汀对缺氧致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用J.中国现代应用药学杂志，2006，23（8）4：279.
