1、基质金属蛋白酶-2 基因在宫颈癌组织中的表达及意义【摘要】目的：研究 MMP- 2 在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭/转移的关系。方法：应用 RT-PCR 的方法检测 48 例宫颈癌组织、正常宫颈组织及 16 例宫颈良性病变组织中MMP-2 的表达情况，并对数据进行分析。结果：MMP-2 在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达率分别为64.58%、37.50%、31.25%，宫颈癌与正常宫颈组织（P=0. 012） 、宫颈癌与宫颈良性病变组织（P=0. 031）间的 MMP-2 表达率差
2、异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的 MMP-2 表达率差异无统计学意义（P=0.091） 。MMP-2 在不同临床分（P=0.001）及淋巴结转移（P=0.002）中的表达率存在显著差异，但在不同年龄患者的癌组织中MMP-2 的表达率无差异（P0.05） 。结论：MMP-2 在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织 MMP-2 与宫颈癌临床分期密切相关，临床分期越晚，其肿瘤组织中 MMP - 2 的表达率越高。伴淋巴结转移宫颈癌 MMP - 2 表达率高于无淋巴结转移者。MMP-2 表达率与患者年龄无关。 【关键词】宫颈癌，机制金属蛋白酶2 ，逆转录聚合酶链
3、式反应 【Abstract】Objective:To study the expression of MMP-2 in human cervical cancer and explore the relationship between MMP-2expression and clinicalpathological feature（s patients age,limph node metastasis,clinical stage,）. Method：The expression of MMP-2 in 48 cases of human cervical cancer tissues,n
4、ormal cervical tissues and 16 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse transcriptase polymerase chainreaction (RT-PCR).Results: Theexpression rate of MMP-2 in cervical cancer，normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 64.58%、37.50%、31.25%,statistical differ
5、ence wasfound among cervical carcinoma group,normal cervical tissues group and benign lesion group.The expression of MMP-2were associated with clinical stage (P=0.001) and lymph node metastasis (P=0.002),but had no correlation with age and tumor size (P0.05).Conclusion:MMP-2expression is increased i
6、n cervical cancertumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue,MMP-2 is relevant with the occurrence of cervical cancer.The cervical cancer cellsproliferation capacity is increase,degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which MMP-2 expressed.
7、 【Key words】Cervical cancer,MMP-2,RT-PCR 基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类活性依赖金属锌离子的蛋白酶,可以有效地降解基底膜和细胞外基质(ECM),从而参与促进肿瘤生长、浸润和转移1。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是 MMPs 家族的重要一员,在多种肿瘤中存在过表达,对肿瘤的侵袭和转移起重要作用。本研究对 MMP-2 在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达进行检测，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭转移的关系。 1 材料与方法 1.1 标本来源 标本均来自我院 2006 年 10 月2009 年 1
8、0 月期间住院手术切除标本共 112 例。其中宫颈良性病变组织 16 例（宫颈糜烂 10 例、宫颈息肉 3 例、宫颈肥大 3 例） 、宫颈癌组织（病理证实为鳞状细胞浸润癌及宫颈腺癌）及正常宫颈组织（因子宫肌瘤行子宫全切患者）各 48 例。病理分级根据 2006 年修订的国际妇产科联盟（FIGO）宫颈癌分期，0 期 5 例，期 28 例，II12 例，期 3 例；伴淋巴结转移 30例，无淋巴结转移 18 例；全部患者术前均未行任何抗癌治疗。所有患者均为女性，宫颈癌患者中位年龄 48 岁（1877 岁） ；宫颈良性病变患者中位年龄 34 岁（2243 岁） 。 1.2 组织总 RNA 的提取和 c
9、DNA 的合成 总 RNA 的提取参照TRIzol 试剂说明书操作,所得 RNA 用 75%乙醇洗涤后晾干,溶于 20ml DEPC水中,再经微量核苷酸定量检测仪测定 RNA 浓度及 A 2 6 0 /A 2 8 0, 琼脂糖凝胶电泳检测 R NA 质量,选取 A260/A280 比值为 1.8-2.0 的 RNA 进行反转,所得的 cDNA 产物在-20保存,用于下一步 PCR。 1.3 逆转录反应 在 20l 的反应体系中加入5reactionbuffer4l，olig（o dT）18Prime（r 0.5g/l）1l，RiboLock TMRibonuclease inhibitor（2
10、0U/l）1l，10mM dNTP 2l，总 RNA2g，逆转录酶 M-MLV1l，DEPC 水补齐至20l，42孵育 60min（逆转录） ，72孵育 10min 以终止反应，于冰上降温（灭活逆转录酶） 。 1.4 PCR 反应 扩增 MMP-2 基因的引物序列，上游引物ACTTTGGCCGCTGGGAGCAT，下游引物：GGCGCTGGTGCAGCTCTCAT，扩增产物长度 410bp，-actin 为内参照，上引物：CAACTTCATCCACGTTCACC，下游引物：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，扩增产物长度 268bp。25l 的反应体中加入 cDNA2l，LOX 上、下游
11、引物各 1l，PCR Master Mx12.5l，去离子水 8.5l 混匀后，置于 PCR 仪中，反应条件：95预变性 10min后，9530s，6130s，7230s，40 个循环，最后 72延伸 10min。 1.5 PCR 产物鉴定 用 1.0%琼脂糖凝胶将提取的 RNA 进行电泳，在紫外线灯下观察。 1.6 统计分析 计数资料采用2 检验及四表格确切概率法，采用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理。 2 结果 2.1 MMP-2 在宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达 MMP-2 在宫颈癌组织中的表达率为 64.58%，而在正常宫颈组织和宫颈良性病变组织中的表达率分别为
12、 37.50%、31.25%。统计学分析，宫颈癌与正常宫颈组织（P=0.012） 、宫颈癌与宫颈良性病变组织（P=0.031）间的 MMP-2 表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的 MMP-2 表达率差异无统计学意义（P=0.091） 。见表 1。 2.2 MMP-2 与临床病理特征的关系 0、期宫颈癌MMP-2 表达率分别为 40.00%、39.29%、100.00%、100.00%，统计学分析，、期宫颈癌 MMP-2 的表达率明显高于 0、期（P=0.001） ；伴淋巴结转移宫颈癌 MMP-2 表达率为 80.00%，明显于无淋巴结转移的33.33%（P=0.00
13、2） ；在 1850 岁、50 岁的患者中 MMP-2 的表达率分别为 60.60%、73.33%，差异无统计学意义（P0.05） 。见表 2。 3 讨论 宫颈癌侵袭转移是其重要的生物学行为,是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移和浸润都需要降解其周围的基质和基底膜2,使肿瘤细胞能够有更多的活动空间及进入周围组织的通道。肿瘤周围的细胞外基质和基底膜的主要成分为型胶原和明胶,是金属基质蛋白酶的主要作用底物,至今3,已经有 20 多种不同的 MMPs 被克隆,其中 MMP-2 是其中作用较强的一种,也被认为是与肿瘤关系最为密的一种。MMP-2 在体内以 72-kDa 的非活化形式分泌,在膜型金属基质
14、蛋白酶(MTI-MMP)的作用下转化为 67-kDa 的活化形式,降解型胶原、纤维连接蛋白和层粘蛋白4。MMP-2 几乎对细胞外所有的基质成分都有一定的降解作用。大量研究表明,在多种恶性肿瘤组织中存在 MMP-2 的过度表达。YOSHINO 等5研究结果显示,黑色素瘤病人血清中 MMP-2 的含量高于正常对照组。LANGENSKIOLD 等6研究结果显示,直肠癌病人血浆 MMP-1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达均升高,认为血浆 MMP-2 水平可作为肿瘤恶性程度的一个相关指标。HPV 是宫颈癌发生的重要病因,SMOLAHESS 等7发现 HPV 阳性宫颈癌细胞系中有MTI-MMP 的表达,
15、过度表达的 MTIMMP 通过活化 MMP-2 与宫颈癌细胞的侵袭性高度相关。在本研究中，MMP-2 在正常宫颈组织及宫颈良性病变组织的表达率分别为 37.50%、31.25%，且差异均无统计学意义，提示 MMP-2 在宫颈良性病变的发生中作用并不十分明显。而在宫颈癌中 MMP-2 高达64.58%，高于正常宫颈组织及良性病变组织，表明 MMP-2 的过度表达与宫颈癌的发生有关。HIF-1 在不同临床分期患者中的表达不完全相同，期、期宫颈癌患者癌组织中的表达率较 0 期、期患者升高。该实验结果反映出 MMP-2 表达的变化趋势，即随着宫颈癌病情的进展，MMP-2 的表达率呈上升趋势。在伴有淋巴
16、结转移的患者中 MMP-2 的表达率明显高于无淋巴结转移患者，提示 MMP-2 可能与宫颈癌发生淋巴结转移有关。而 MMP-2 在不同年龄组的宫颈癌患者中的表达率在统计学上无显著差异（P0.05） ，表明 MMP-2 与患者年龄无关。以上研究表明 MMP-2 与宫颈癌的生存率有关。MMP-2 高表达者 TNM 分期晚,分化低,并易出现淋巴结转移,提示 MMP-2 可以作为判断宫颈癌恶性类型的有用指标。MMP-2 表达率与患者年龄无关。 参考文献 1 ADITHI M,NALINI V,KANDA L,et al.Expression of matrixmetalloproteinases an
17、d their inhibitors inretinoblasto-maJ.J PediatrHematol Oncol,2007,29(6):399-405. 2 Takahashi E,Tateyama H,Akatsu H,et al.Expressionof matrix metalloproteinases 2 and 7 in tumorcells correlates with the World Health Organizationclassification subtype and clinical stage ofthymic epithelial tumorsJ.Hum
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19、f themembrane-bound collagenase MT1-MMPJ.Mol BiolCell, 2006,17(12):5390-5397. 5 YOSHIO Y,KAGESHITA T,NAKAJIMA M,et al. Clinicalr e l e v a n c e o f s e r u m l e v e l s o f m a t r i xmetalloproteinase-2,and tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1 and-2 in patientswith malignantmelanomaJ.Dermatol,2
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