1、基质金属蛋白酶-3、10 在子宫内膜腺癌组织中的表达作者：冯骏，苟文丽，刘丹，李旭【摘要】 目的 了解基质金属蛋白酶-3、10(MMP-3、MMP-10)在子宫内膜腺癌组织中的表达情况，及与病变的浸润程度、组织学分级、临床分期等方面的关系，探讨 MMP-3、MMP-10 在子宫内膜癌的发病、浸润和转移中的作用及意义。方法 采用免疫组织化学方法分别检测 42例子宫内膜癌、12 例非典型增生、12 例正常子宫内膜组织中 MMP-3、MMP-10 的表达，并进行统计学分析。结果 本实验结果显示，子宫内膜腺癌、子宫内膜不典型增生过长和正常子宫内膜组织中 MMP-3阳性表达率分别为73.8%(31/42
2、)、25.0%(3/12)、8.3%(1/12)，MMP-10 阳性表达率分别为76.2%(32/42)、33.3%(4/12)、0%(0/12)。MMP-3、MMP-10 的表达均呈逐渐下降趋势，每两组的统计学检验显示，MMP-3、MMP-10 在子宫内膜腺癌与子宫内膜不典型增生过长、子宫内膜腺癌与正常子宫内膜组织之间，均有统计学差异(P0.01)；MMP-3、MMP-10 的表达与组织学分级、肌层浸润程度、临床分期均有关(P0.01)；MMP-3、MMP-10 在子宫内膜腺癌中的表达有明显相关性(P0.01)，联合检测 MMP-3、MMP-10 可提高子宫内膜腺癌的检出率。结论 MMP-3
3、与 MMP-10可作为子宫内膜腺癌的肿瘤标志物之一，且联合检测 MMP-3与 MMP-10可提高子宫内膜腺癌的检出率。 【关键词】 子宫内膜腺癌；基质金属蛋白酶-3；基质金属蛋白酶-10ChinaABSTRACT: Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) in normal endometrium, atypical hyperplasia and endometrial adenocarcinoma. W
4、e aimed to study the relationship of MMP-3 and MMP-10 expressions with infiltration depth, histologic grade and clinical phase in order to explore the role of MMP-3 and MMP-10 in the occurrence, infiltration and metastasis of endometrial adenocarcinoma. Methods The expressions of MMP-3 and MMP-10 we
5、re measured by immunohistochemistry in 12 cases of normal endometrium, 12 cases of atypical hyperplasia and 42 cases of endometrial adenocarcinoma. Results The expression of MMP-3 was 73.8% (31/42), 25.0% (3/12) and 8.3% (1/12) in endometrial adenocarcinoma, atypical hyperplasia and normal endometri
6、um, respectively, whereas the expression of MMP-10 was 76.2% (32/42), 33.3% (4/12) and 0(0/12), respectively. Both MMP-3 and MMP-10 expressions exhibited a pattern of decreased intensity in endometrial carcinoma, atypical hyperplasia and normal endometrium. Furthermore, the statistical analysis show
7、ed that the expression of both proteins was significantly greater in endometrial carcinoma than in atypical hyperplasia and normal tissue (P0.01). Expressions of MMP-3 and MMP-10 had a significant correlation with such clinical parameters as histologic grade, depth of myometrial infiltration and cli
8、nical stage (P0.01). Conclusion MMP-3 and MMP-10 can be used as tumor markers of endometrial carcinoma, and the combined detection of them can increase the detection rate of endometrial carcinoma.KEY WORDS: endometrial carcinoma; matrix metalloproteinase-3; matrix metalloproteinase-10恶性肿瘤侵袭和转移的先决条件是
9、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解。ECM 是由胶原、蛋白多糖及糖蛋白等成分构成的细胞外骨架结构。基质的降解和基底膜的重塑及穿出血管壁进入微环境的过程，对于癌细胞侵袭转移过程来说是关键环节。研究表明，癌细胞可产生大量分解酶降解基质或基底膜。这些分解酶与癌侵袭转移能力显著相关。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一组调节复杂的，锌离子依赖性的内肽酶，是一多基因家族，是人体内降解 ECM的主要酶类，是一类与肿瘤浸润和转移密切相关的生物酶。MMPs 可以通过降解 ECM、调节细胞凋亡、增加细胞黏附能力、促进新血管生成来促
10、进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，从而参与肿瘤演进等众多生理和病理过程1。基质溶解素是 MMPs中非常重要的一个种类，包括 MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11 等，可以降解 ECM的主要结构，包括、型胶原、纤维连接蛋白、层粘蛋白、蛋白多糖等。目前，对基质溶解素在肿瘤侵袭与转移中的作用研究较少，尤其是基质溶解素-1(MMP-3)、基质溶解素-2(MMP-10)在子宫内膜癌中的作用国内外报道罕见。因此，探讨子宫内膜癌组织中 MMP-3、MMP-10 的表达及其相关性具有一定的创新性和实用性。本研究应用免疫组化方法检测正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜腺癌组织中 MMP-3和 M
11、MP-10的蛋白表达情况，以及其表达变化与组织学分级、肌层浸润程度、临床分期的关系，并结合临床病理特征，初步探讨 MMP-3和 MMP-10与子宫内膜腺癌发生、发展的关系及其临床意义。1 材料与方法1.1 资料来源 收集 1996年 1月至 2004年 6月西安交通大学医学院第一附属医院妇产科术前均未经放、化疗或激素治疗的子宫内膜腺癌患者的石蜡包埋标本 42例，不典型增生子宫内膜患者石蜡包埋标本 12例和正常子宫内膜包埋标本 12例(增生期 5例，分泌期 4例，萎缩性子宫内膜 3例)。以上标本均行常规病理学检查及 HE染色确诊，实验过程中经病理医师复诊。子宫内膜腺癌临床分期参照国际妇产科联盟(
12、FIGO，1988)，组织学分级参照国际妇产科联盟(FIGO，1988)。42 例子宫内膜腺癌组织标本中，临床分期期 18例，期 12例，期 11例，期 1例；组织学分级级(高分化腺癌)12 例，级(中分化腺癌)15 例，级(低分化腺癌)15 例；子宫内膜腺癌均无宫体外转移，限于内膜层，无肌层浸润 10例，浅肌层浸润(1/2 肌层)18 例，深肌层浸润(1/2 肌层)14 例(分别见表 2、表 3、表 4)；子宫内膜腺癌患者年龄 3876 岁，平均(586.1)岁。不典型增生子宫内膜患者年龄 4467 岁，平均(565.3)岁。正常子宫内膜患者 3550 岁，平均(424.2)岁。上述标本均经
13、 100g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，5m 连续切片，分别做 HE和 EliVisionTM plus免疫组织化学染色。1.2 实验试剂 第一抗体试剂：鼠抗人 MMP-3单克隆抗体浓缩型，0.1mL，工作浓度 150，购于武汉博士德生物工程有限公司；鼠抗人 MMP-10单克隆抗体浓缩型，0.1mL，工作浓度 150，购于武汉博士德生物工程有限公司。第二抗体试剂：EliVisionTM plus鼠免疫组化试剂盒，购于福州迈新生物工程有限公司。显色剂：DAB 显色剂，购于福州迈新生物工程有限公司。1.3 实验方法 采用 EliVisionTM plus 二步法免疫组化染色检测 MMP-3、MMP-
14、10在子宫内膜癌组织中的表达。阳性对照：用武汉博士德生物有限公司提供的 MMP-3、 MMP-10阳性对照片作为阳性对照；阴性对照：用 PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。1.4 结果判定 光学显微镜下，见肿瘤细胞质中出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。MMP-3、MMP-10 表达阳性和阴性，根据细胞染色强度和染色细胞所占比例两者积分之和来判断。评分方法：观察每例组织切片，随机选择 5个高倍视野(1040)，计数肿瘤细胞总数和阳性细胞个数，得出阳性细胞百分率。着色强度为多数阳性细胞呈现的染色计分。染色强度积分为：不染色=0，淡黄色=1，黄色=2，桔黄色=3，棕黄色=4；05%细胞染色=0，6%50
15、%细胞染色=1，50%细胞染色=2。综合评分：03 分为阴性，46 分为阳性。1.5 统计学分析 采用 2 检验，校正 2 检验，确切概率法，3 者之间比较采用Kruskal-wallis法检验，3 组之间两两比较采用 Bonfferoni法检验，以P0.05为有统计学意义。2 结 果2.1 MMP-3、MMP-10 在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜及子宫内膜腺癌组织中的表达MMP-3 从正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜至子宫内膜腺癌组织中的表达呈现逐渐升高趋势。正常子宫内膜组与不典型增生子宫内膜组之间比较，无统计学差异(P0.05)；正常子宫内膜组与子宫内膜腺癌组之间比较，具有统计学差异(
16、P=0.000)；不典型增生子宫内膜组与子宫内膜腺癌组之间比较，具有统计学差异(P=0.002，表 1)。MMP-10从正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜至子宫内膜腺癌组织中的表达呈现逐渐升高趋势。正常子宫内膜组与不典型增生子宫内膜组之间比较，无统计学差异(P0.05)；正常子宫内膜组与子宫内膜腺癌组之间比较，具有统计学差异(P0.01)；不典型增生子宫内膜组与子宫内膜腺癌组之间比较，具有统计学差异(P0.01，表 1)表 1 正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜及子宫内膜腺癌组织中 MMP-3、MMP-10表达的比较（略） 。MMP-3在正常子宫内膜及不典型增生子宫内膜组织中仅表现为胞质内浅黄色淡
17、染，而在子宫内膜腺癌组织中大部分细胞质呈强染色，呈深棕黄色(图 1)。MMP-10 阳性表达主要定位在细胞质，呈棕黄色颗粒状。在正常子宫内膜细胞大部分无着色或呈现细小均匀的淡黄色；在不典型增生子宫内膜中阳性着色强度不一，多为淡黄色；而在子宫内膜腺癌中的细胞胞质内多为阳性或强阳性着色，着色均匀或黄色颗粒布满细胞质(图 1)。2.2 MMP-3、MMP-10 与子宫内膜腺癌组织学分级的关系 3 组之间比较，采用 Kruskal-walli法检验，显示 MMP-3、MMP-10表达与子宫内膜腺癌组织学分级有关，随着肿瘤细胞分级升高，MMP-3、MMP-10 表达有逐步升高趋势(P0.01，表 2)。
18、表 2 MMP-3、MMP-10在子宫内膜腺癌不同组织学分级中的表达（略）2.3 MMP-3、MMP-10 与子宫内膜腺癌浸润程度之间的关系 3 组之间比较，采用 Kruskal-walli法检验，显示 MMP-3、MMP-10表达与子宫内膜浸润程度有关，随着肿瘤细胞浸润程度加深，MMP-3、MMP-10 表达有升高趋势(P0.01，表 3)。表 3 MMP-3、MMP-10与子宫内膜腺癌不同肌层浸润程度中的表达（略）2.4 MMP-3、MMP-10 与子宫内膜腺癌临床分期之间的关系 3 组之间比较，采用 Kruskal-walli法检验，显示 MMP-3、MMP-10表达与子宫内膜腺癌临床分
19、期有关，随着临床分期增加，MMP-3、MMP-10的表达有逐步升高趋势(P0.01，表 4)。表 4 MMP-3、MMP-10 在子宫内膜腺癌不同临床分期中的表达（略）2.5 子宫内膜腺癌中 MMP-3与 MMP-10的相关性 结果显示：MMP-3 与 MMP-10在子宫内膜腺癌的检测中具有明显的相关性(表 5)。表 5 MMP-3与 MMP-10的相关性（略）2.6 联合检测 MMP-3与 MMP-10的阳性表达率 联合检测 MMP-3与 MMP-10，在子宫内膜腺癌中总阳性表达率为88.1%(35/42)，明显高于 MMP-3单独在子宫内膜腺癌中的阳性表达率(P0.05)，但与 MMP-1
20、0在子宫内膜腺癌中的阳性表达率无明显差异(P0.05，表 6)。 表 6 MMP-3和 MMP-10联合阳性表达率与单独MMP-3、MMP-10 的阳性表达率的比较（略）3 讨 论侵袭与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，ECM 的降解主要依靠蛋白水解酶，是肿瘤侵袭正常组织和开始转移的信号及重要途径。MMPs 是一类重要的细胞外基质降解酶2，几乎能降解 ECM的所有成分。正常组织细胞中没有或仅有较弱的 MMPs表达，恶性组织细胞中MMPs的表达明显高于良性肿瘤及正常组织3-4。TAMAKOSHI 等5研究了多种类型的妇科恶性肿瘤，认为 MMPs 与宫颈癌和子宫内膜癌的侵袭、转移关系最为密切。关于
21、MMPs与子宫内膜癌发病的关系，许多学者选择了明胶酶(MMP-2 和 MMP-9)进行研究，并发现 MMP-2及 MMP-9的过度表达与子宫内膜癌的侵袭转移有关，而有关基质溶解素的研究相对较少。基质溶解素是 MMPs中非常重要的一个种类，包括基质溶解素-1(MMP-3)、 基质溶解素-2(MMP-10)、MMP-7、 MMP-11 等，可以降解 ECM的主要结构，包括、型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖等，基质溶解素在肿瘤侵袭与转移中的作用研究尚处于初级阶段，有研究表明，MMP-3和 MMP-10在所有结、直肠癌组织中强阳性表达6。关于 MMP-3、MMP-10 在子宫内膜癌中的研究鲜
22、见报道。已有大量实验证明，不同月经周期的子宫内膜均有 MMPs的表达，且表达的部位及量有所不同。RODGERS 等7利用原位杂交和免疫组化法，检测到子宫内膜中存在 MMPs及其 RNA的表达，且各种 MMP基因表达的时间也有所不同，MMP-3、MMP-10 只表达于分泌晚期和月经期子宫内膜。GOFFIN等8用 RT-PCR法检测子宫内膜，发现 MMP-3仅表达于月经期。本实验结果显示，MMP-3、MMP-10 在正常子宫内膜几乎不表达，与上述观点一致。在正常子宫内膜组与不典型增生子宫内膜组之间，MMP-3 和MMP-10表达无显著差异(P0.05)。在 42例子宫内膜腺癌患者癌组织中，MMP-
23、3 和 MMP-10表达阳性率明显高于不典型增生子宫内膜组和正常子宫内膜组(P0.01)，且在子宫内膜腺癌组中，临床分期越晚，肿瘤细胞分化程度越差，肌层浸润程度越深，MMP-3 和 MMP-10的阳性表达率越高，提示恶性程度高的癌细胞可能对 MMP-3 与 MMP-10的表达有更强诱导能力。因而，也有更强的侵袭转移能力。此结果表明 MMP-3、MMP-10可作为子宫内膜腺癌的肿瘤标志物之一，且与肿瘤细胞的浸润和转移有关，与 UENO等9的研究结果不一致。大量研究表明10，MMPs 在肿瘤转移中有如下作用：破坏局部组织结构,促进肿瘤生长；破坏基底膜屏障,有利于肿瘤的转移；通过对 ECM的改建,促
24、进肿瘤新生血管的形成。许多研究表明在恶性肿瘤中基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)的表达随着 MMP的表达升高而升高，但MMP表达程度总是高于 TIMP，正是由于这两者之间的平衡被打破，才导致了恶性肿瘤的侵袭和转移11-12 。本研究发现，随着病变发展，MMP-3与 MMP-10表达均呈逐步升高趋势，两者呈正相关。MMP-10 在子宫内膜腺癌的表达似乎比 MMP-3略强，提示两者在子宫内膜腺癌的发展进程中，可能发挥协同作用。目前，关于肿瘤组织中 MMP-3与 MMP-10的细胞来源尚不清楚，多认为是肿瘤周围的基质成纤维细胞产生。影响 MMP-3与 MMP-10基因表达的因素很多，如 TGF-、TNF-、PDGF、EGF、bFGF、C-Fos、C-Jun 等，对子宫内膜腺癌患者 MMP-3与 MMP-10基因表达增强的调控机制仍需进一步研究。本研究结果显示，MMP-3 与 MMP-10在子宫内膜癌组织中表达均明显增高，癌细胞分化程度越差、肌层浸润越深、临床分期越高，其表达越强，MMP-3 与 MMP-10呈正相关。该结果与 MMPs在肿瘤的侵袭转移方面的相关研究结论一致，为基质溶解素在妇科肿瘤学中的研究提供了一定的依据。【参考文献】1CHAMBERS AF, MATRISIAN LM.Changing view of the role of
