1、姜黄素体内外给药及含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响作者：冯文茹，赵秀梅，刘利萍，胡人杰【摘要】 目的探讨姜黄素 3 种不同给药途径对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。方法通过噻唑蓝（MTT）比色法比较姜黄素 3 种给药途径对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果姜黄素体内给药和含药血清能够促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，体外实验证实姜黄素能够抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖，并呈量效关系。结论姜黄素与其代谢产物对淋巴细胞增殖作用的影响是相反的。 【关键词】 姜黄素； 淋巴细胞； 含药血清Abstract：ObjectiveTo probe into the hyperplasy effect of different cu
2、rcumine administered approaches for the splenic lymphocyte of mice.MethodsThe effect of curcumine on the proliferation of spleen lymphocytes through three different administration routes were determined with MTT test. ResultsCurcumine administrated in vivo and its drug serum upregulated the prolifer
3、ation of spleen lymphocytes.Out-of-body experience certified curcumine could suppress the hyperplasy of the mice splenic lymphocyte. It presented dose-effect relationship. ConclusionIt is contrary that the effect of curcumine and its metabolite on the proliferation of spleen lymphocytes.Key words：Cu
4、rcumin ; Lymphocyte; Drug serum姜黄素是中药姜黄的主要成分，有很重要的经济价值和广泛的药理作用。如抗氧化、抗炎、降血脂、抗肿瘤等1 。近些年来有关姜黄素生物活性的研究越来越多。体外实验证实姜黄素具有免疫调节的作用2 ，但其对体内给药的免疫调节的作用未见报道。本文通过体内外及血清药理学的对比实验着重对此进行了研究观察，以期为进一步研究其免疫药理作用提供实验依据。1 材料1.1 动物 ICR 小鼠 雌性，体重 1820 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物合格证编号：0034800。1.2 试剂与仪器 RPMI1640，批号 1285082，GIBCO 公
5、司产品；刀豆蛋白（ConA） ，Sigma 公司提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT） ，北京欣经科生物技术有限公司产品，批号：T15051/15181；姜黄素，由本所植化室提供；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号：061201。CO2 孵箱，REVCO；电子天平，METTLER，AE240；96 孔板，由greiner bio-one 提供；酶标仪，well scan MK3 Labsystems Dragom。2 方法2.1 姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响 ICR 小鼠 60 只，分为 5 组，即正常对照组和姜黄素 4 个剂量组，对照组每日灌胃生理盐水，姜黄素给药组分别每日灌
6、胃给药 50，100，200 和 400 mg/kg 的姜黄素。连续给药 7 d，于末次给药后，取各种小鼠脾脏无菌制备单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为 4106/ml，置于 96 孔板中，并增设 ConA 对照组（浓度为 5 g/ml） ，该组细胞悬液取自正常对照组。取每只小鼠的脾细胞悬液 75 l 加入 96 孔板中，并设 4 个复孔。除正常对照组，其余各组均加入 25 l ConA；随后，正常对照组加入 125 l RPMI1640 培养液，其余各组各孔均加入 RPMI1640 培养液 100 l，使反应总体积为200 l/孔。置 5%CO2 孵箱 37培养 72 h，培养结束前 4 h，每
7、孔加入10 l MTT(5 mg/ml)，继续培养 4 h，培养结束后， 1 000 r/min 离心10min，弃上清液，每孔加入 150 l DMSO，充分振荡后室温静置 10 min。进行酶标仪检测，读取 A570nm 值。2.2 姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响在无菌条件下，常规制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为 4106/ml，然后按实验分组：细胞对照组、ConA 对照组、ConA姜黄素组。将新分离的小鼠脾细胞悬液加入 96 孔板中，各组均加入细胞悬液 75 l/孔，ConA 对照组和 ConA姜黄素组加 ConA 25 l/孔。然后 ConA姜黄素组加入含有不同浓度姜黄素（0.88
8、，1.76，3.52，7.03，14.06，28.13，56.25，112.5，225 g/ml）的 RPMI1640 培养液 100l/孔。设 4 个复孔。姜黄素药物对照组加入含上述不同浓度姜黄素的 RPMI1640 培养液 100 l，再加入RPMI1640 培养液 100 l。细胞对照组和 ConA 对照组分别加入 RPMI1640培养液，使反应总体积为 200 l/孔。加样完毕置 5%CO2 孵箱 37培养72h，培养结束前 4 h，每孔加入 10 l MTT(5 mg/ml)，继续培养 4 h，培养结束后，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，每孔加入 150 lDM
9、SO，充分振荡后室温静置 10 min。进行酶标仪检测，读取 A570 nm值。2.3 姜黄素含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响2.3.1 含药血清的制备 ICR 动物 20 只，分为 5 组，每组 4 只，即正常对照组和姜黄素 50 ，100，200 和 400 mg/kg，对照组灌胃生理盐水，给药组灌胃不同浓度的姜黄素， 0.2 ml/10 g 体重，连续给药 5 d，末次给药后 1，2 和 4 h 摘眼球无菌取血，3 000 r/min 离心 10 min，无菌分离血清后，每组合并血清，经 56 30 min 灭活，-20保存，1 个月内使用。2.3.2 淋巴细胞增殖活性的测定无菌制备脾
10、细胞悬液，调整细胞浓度为 4106/ml，按上“含药血清的制备”分组进行加样。参照文献3 ，于 96 孔培养板每孔加入 100 l 脾细胞悬液，再加入 80 l ConA（2.5 g/ml）及 20 l 不同时相含药血清，使每孔含药血清的含量为 10%，设 4 个复孔。对照组加入相应体积的无药血清培养。加样完毕置 5%CO2 孵箱 37培养 72 h，培养结束前 4 h，每孔加入 10 l MTT(5 mg/ml)，继续培养 4 h，培养结束后，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，每孔加入 150 l DMSO，充分振荡后室温静置 10 min。进行酶标仪检测，读取 A570
11、 nm 值。2.4 统计学分析数据以s 表示，用 t 检验统计。3 结果3.1 姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响实验结果见表 1。由表 1 可见，姜黄素在 50，100，200 和 400 mg/kg 之间，在 ConA 的诱导下，随着药物浓度的增加，增殖活性也在逐渐增加，基本呈量 效关系。表 1 姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）3.2 姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响由表 2 可见，姜黄素体外实验各给药组与 ConA 组比较，在浓度为 0.883.52g/ml 时，除浓度 0.88g/ml 似有促进增殖作用（无统计学意义）外，基本可以看出在该浓度范围姜黄素对淋巴细胞增殖作用
12、无明显的影响。姜黄素在浓度 7.03225g/ml 之间时则表现出明显的抑制 ConA 诱导的脾淋巴细胞增殖的作用，该抑制作用基本上呈剂量依赖性。表 2 姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）与 ConA 对照组比较， P0.013.3 姜黄素含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响由表 3 可见，姜黄素含药血清浓度为 10%时，400 mg/kg 组与 ConA 对照组比较 1，2 h时相未表现出增殖活性，4 h 时增殖活性明显。50200 mg/kg 组与对照组比较，1，2 和 4 h 时均表现出明显的增殖活性， P0.01。表 3 姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）与对照组比较，P
13、0.014 讨论维持机体免疫功能主要依赖于各种功能正常的免疫细胞和细胞之间的相互作用。其中 T 淋巴细胞多数寄居在脾脏，参与细胞免疫，是特异性免疫应答的基础4 。本实验通过 3 种作用途径观察姜黄素对淋巴细胞转化功能的影响。姜黄素口服给药 50，100，200 和 400 mg/kg 这 4 个剂量组的脾淋巴细胞，在 ConA 的诱导下，随着药物浓度的增加增殖活性也在增加，说明姜黄素口服给药可以提高机体的特异性免疫功能。姜黄素体外实验表明，姜黄素在 0.883.52 g/ml 时，对 ConA 诱导的脾淋巴细胞的增殖无影响，在浓度 7.03225 g/ml 之间明显的抑制了 ConA诱导的脾淋
14、巴细胞的增殖，与文献报道的结果相近2 。根据文献报道5 ，我们采集了姜黄素口服末次给药后 1，2，4 h 的血，分离出血清，在体外实验中，姜黄素含药血清表现出一定的增殖活性与体内实验结果相一致。姜黄素体内外实验结果相佐，即姜黄素体外表现出强烈的细胞毒活性，而体内（包括含药血清）表现出明显地促进淋巴细胞增殖的活性，提示姜黄素口服后可以吸收，通过吸收入血后发挥其药理作用；口服姜黄素所产生的体内免疫增强作用其物质基础很可能不在于姜黄素本身而是其相应的代谢产物。有关姜黄素的药代动力学实验研究表明，姜黄素的血药浓度低或基本测不到，生物利用度不高，可能与其吸收、代谢有关。口服姜黄素在小肠吸收时有生物转化（
15、与葡萄糖醛酸，硫酸结合，还原为四氢姜黄素和六氢姜黄素） ，但结合和还原的比例还不明确。在肝中也有姜黄素结合或还原产物。姜黄素主要是在小肠还是在肝中进行的生物转化及转化产物的作用尚未确定5 。总之本项研究表明，姜黄素与其“代谢产物”有着不同的生物活性，体外姜黄素表现出明确的细胞毒活性2 ，而其“代谢产物”的细胞毒活性“消失” 。我们另一项实验结果证实，与姜黄素本身比较它的含药血清不具有抗肿瘤增殖的生物活性。同时，本实验结果尚可证实，姜黄素口服给药在体内最终发挥生物作用的是其代谢产物而非原型药物，当然这一结论的确证最终尚需进一步证实。此外，通过本项实验观察进一步验证了中药体内给药与其含药血清体外实
16、验结果的一致性，即含药血清体外实验结果与体内实验结果相符合。4h 采集的含药血清诱导小鼠脾细胞增殖的活性明显高于 1 和 2 h 采集的血清，这一现象与一般认为大多含药血清采集在 12 h（多数药物口服给药后达峰时间）活性较强不符6 ，结合文献资料单次口服姜黄素达峰时间为 0.751 h5 ，进一步提示姜黄素体内免疫增强（调节）作用来自其代谢产物而非其本身。【参考文献】1 国家药典委员会. 中国药典S.北京:化学工业出版社,2000:218.2 李新建,刘晓城. 姜黄素调节小鼠免疫功能的实验研究J. 中国组织化学与细胞化学杂志,2005,14（2）:132.3 梁春敏,王贤喜. 玉屏风散对小鼠
17、免疫调节作用的血清药理学研究J. 上海免疫学杂志,2003,23（6）：385.4 Bielak-Zmijewska A, Koronkiewicz M,Skierski J, et al. Effect of curcumin on the apoptosis of rodent and human nonproliferating lymphoid cellsJ. Nut Cancer,2000,38:131.5 王 旗，王 燮. 姜黄素的代谢研究J. 中国药理学通报，2003，19(10):1097.6 刘建文. 药理实验方法学-新技术与新方法M. 北京:化学工业出版社,2003: 258
