1、可注射性同种异体工程化软骨的构建作者：罗家胜 李贵泽 崔鹏程 高鹏飞 【关键词】 软骨 关键词: 软骨;软骨细胞;生物医学工程;生物相容性材料 摘 要:目的 研究在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨的可行性;并验证本实验使用的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝胶（Copolymer gel of ethylene and propylene oxide）在组织工程研究中应用的可行性. 方法 无菌条件下取新生兔关节软骨，经型胶原酶消化，将软骨细胞和生物材料复合成细胞浓度为 5107 ml -1 的复合物并移植于兔皮下，同时设立单独注射细胞和材料两个对照组.分别于 4，6，8，12wk 取材行大体观察
2、，石蜡切片 HE 染色，Safranin O 染色，Massons 三色染色，了解软骨形成情况. 结果 2wk 后即可于皮下触及新生结节，4wk 后取材即有基质分泌及胶原形成.于 6wk 左右软骨接近成熟，生物材料基本吸收.8，12wk 软骨基本接近正常软骨.实验中未见明显的免疫排斥反应.而对照组未见软骨形成. 结论 该实验使用的生物材料具有良好的生物相容性，可降解性，无细胞毒，是较理想的组织工程生物材料;应用该实验的方法可在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨，这为临床某些美容和重建手术提供了一种微创而可塑型的可能的手段. Keywords:cartilage;chondrocytes;
3、biomedical-engineering;biocompatible materials Abstract:AIM To study the feasibility of the formation of allogeneic tissue engineered cartilage in immunocompetent an-imal and to verify that the material used in our experiment has the ideal features as tissue-engineering biomaterial.METHODS Fresh new
4、born rabbitsarticular cartilages were obtained under sterile condition（6h after death）and incu-bated in the sterile3gl-1 typecollagenase solution.Af-ter digestion of812h，the solution was filtered through a150micron nylon mesh and centrifuged，then the chondro-cytes were washed twice with phosphate bu
5、ffered saline（PBS）and mixed with the biomaterial to create a final cell density of5107 ml-1 .The resulting cell-biomaterial admix-ture was injected subcutaneously0.3ml each point，and the control groups were injected with only the biomaterial or the suspension of chondrocyte with the density of5107 m
6、l-1 .After4，6，8and12weeks，the neocartilages were harvested for analysis.RESULTS We touched the new nodes subcuta-neously after2wk.In the sections of the samples harvested after4wk，we found that the matrix was secreted and the collagen formed.After6wk，the neocartilages were mature and the biomaterial
7、 was almost completely degraded.In the experiment groups we observed no obvious immune rejection response.On the contrary，in the control groups there were no neocartilage formed.CONCLUSION Biomaterial used in our experiment is a relatively ideal tissue-engineering bioma-terial.Its feasible to form a
8、llogeneic tissue engineered carti-lage in an immunocompetent animal that provides an alterna-tive minimum traumatic，malleable and injectable means for some clinic plastic and reconstructive operation. 0 引言 在临床工作中，治疗由于软骨缺损导致功能障碍或畸形的病人多用同种异体，自体或人工合成替代物治疗.但由于存在免疫排斥，取材受限及感染等问题，临床医生正在寻找一种更为理想的治疗方法.组织工程的应
9、用是解决上述问题的一个新途径1-2 .目前软骨的组织工程研究已取得了很大进展1-4 .但由于形成组织工程软骨所需的软骨细胞数量大，取自体软骨量小不足以形成新软骨，量大则造成新的损伤.而软骨细胞培养扩增后其分泌基质及分裂能力将逐渐减弱3 .这就使得软骨“种子”细胞的数量问题成为制约这一技术发展的一个因素.本实验应用国内自行合成的可注射性生物材料聚氧化乙烯丙烯凝胶与同种异体软骨细胞混合，探讨在有免疫力的动物体内形成新软骨的可行性. 1 材料和方法 1.1 材料 新西兰大白兔 12 只（清洁级，体重 1.52.0kg，第四军医大学动物中心提供） ，新生兔（12d）20 只，型胶原酶（Sigma 公司
10、） ，250gL-1 聚氧化乙烯丙烯凝胶（第四军医大学口腔医学院陈富林博士提供） ，Ham-F12 培养基（Gibco 公司）. 1.2 软骨细胞分离 新生兔于 750mLL-1 酒精中浸泡处死，无菌条件下切取膝关节，盂肱关节，髋关节等处软骨，去除表面软组织，切成约 2mm2mm2mm 大小的碎块，以磷酸盐缓冲液（PBS，含青、链酶素各 100umL -1 ）冲洗二遍，加入约 2 倍体积 3gL-1 型胶原酶于 37恒温消化 812h，每 30min 摇动一次.以 150 目尼龙网筛过滤，离心，沉淀细胞以 PBS 洗涤 2 遍.用含 200mLL-1 胎牛血清的 Ham-F12 培养基制成细胞
11、悬液，计数，台盼蓝染色检查活力，活力大于 85%备用. 1.3 软骨细胞与生物材料复合物的制备和移植 用上面制备的软骨细胞与聚氧化乙烯丙烯凝胶混合制备成细胞浓度为 5107 mL-1 的复合物 5 .用 12 号针头将其接种到 12 只新西兰大白兔背部皮下，每只 2 点，每点 0.3mL.同时在 12 只新西兰大白兔背部皮下分别注射聚氧化乙烯丙烯凝胶和浓度为 5107 mL-1 的细胞悬液每只各一点，每点 0.3mL，作为对照.分别于 4，6，8，12wk 后取材.实验组每次取材 6 点，对照组各取3 点.行大体观察，常规石蜡切片 HE 染色，Safarinin O 染色，Massons 三色
12、染色，了解软骨的形成情况. 2 结果 实验组 2wk 后可于皮下触及新生软骨结节，质韧.4wk 取材见新生结节呈白色，表面有轻度纤维包裹，质地较 2wk 时硬，切片 HE 染色见已有部分较小的陷窝形成，但软骨细胞形态尚不十分典型，软骨周边有部分淋巴细胞浸润，聚氧化乙烯丙烯凝胶尚未完全吸收，Safranin O 染色见有糖氨多糖（GAG）分泌，Massons 三色染色见已有胶原形成.6wk 以后其表面纤维包裹增厚，去除包裹后见软骨显磁白色，软骨质地接近正常软骨，HE 染色见软骨陷窝明显，细胞形态基本正常，周边少许淋巴细胞浸润，聚氧化乙烯丙烯凝胶已基本吸收，Safranin O 染色及 Masso
13、ns 三色染色显示 GAG 的分泌和胶原形成的 量均较 4wk 时多（Fig1，2）.8wk 及 12wk 后淋巴细胞浸润和纤维包裹情况比第 4wk 并无增多增厚，而镜下形态更接近正常软骨（Fig3）.对照组则无软骨形成. 图 1 图 3 略 3 讨论 组织工程方法可以避免因取材而造成的组织缺损和因应用异体组织及人工替代物而导致的排斥反应及感染等并发症，在修复重建中有广阔的应用前景.以前的研究多应用无免疫力的裸鼠作为实验动物，并已形成了人耳等形状的软骨6 .同时在有免疫力的动物体内应用自体软骨细胞也已形成了工程化软骨5 .但软骨“种子”细胞的数量一直是软骨组织工程研究需要解决的问题.本实验证明
14、同种异体软骨细胞应用组织工程的方法同样可在有免疫力的动物体内形成新的软骨而无明显的排斥反应.这一方面可能由于软骨细胞免疫原性较弱;同时由于生物材料包裹住了软骨细胞，隔离了与免疫细胞的接触，而当生物材料降解吸收以后，重新形成的基质又起到了免疫屏蔽作用;另一方面由于经消化后其细胞表面抗原受到破坏，从而减弱了排斥反应.本实验证明 6wk 以后软骨基本接近成熟，与以往文献报道结果一致5 .由于本实验采用的是异体软骨细胞，在实验中观察到有较轻的排斥反应，所形成的软骨在体内长期的转归结果尚需进一步的实验观察. 组织工程生物材料是组织工程的一个重要内容.目前尚无商品化的生物材料，国内外实验室中应用的生物材料
15、种类繁多，包括 PGA，PLA，藻酸盐，胶原，Pluronic（Co-polymer gel of ethylene and propylene oxide）等，均取得了一定的效果2，5-9 .而以上的材料多为国外合成，价格昂贵，难于购买.Cao 等6 曾对 PGA，藻酸盐，Pluronic 进行比较研究发现 Pluronic 在组织相容性等方面均优于其余二者.本实验采用的国内自行合成的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝胶与 Pluronic 是同类聚合物，它是一种温度敏感材料，在约 05时为液态，超出此范围则变为凝胶.通过本实验证明其可降解，具良好的生物相容性和细胞亲和性，无细胞毒，降解时间约为 6w
16、k 左右.不失为一种较理想的组织工程生物材料.由于其可注射性及温度敏感性，为某些美容及重建手术提供了一种新的，可塑型而微创的可能手段. 参考文献: 1Joseph P.Vacanti，beyond transplantation J.Arch Surg，1988;123（5）:545-549. 2Mao TQ.The history，current situation and future of the tissue engineering J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（3）:185-188. 3Askik
17、u SK，Randolph，Vacanti CA.Tissue engineered cartilage J.Mater Sci Forum，1997;250:129-150. 4Chen FG，Cao YL，Shang QX.The progress in the study of ar-ticular cartilage defect repairment J.Zhongguo Xiufu Chongjian WaikeZazhi（Chin J Repair Reconstr Surg，1998;12（5）:297-300. 5Xia WY，Cao YL，Shang QX，Chen FG，
18、Liu YC，Wang Zh.The experiment on optimal cell density and formation time of tissue engineered autologous cartilage J.Zhongguo Xiufu Chongjian WaikeZazhi（Chin J Repair Reconstr Surg，1999;13（4）:244-248. 6Cao YL，Joseph P.Vacanti，Keith T.Paige，J-oseph Upton and Charles A.Vacanti，Transplantation of cho-n
19、drocytes uti-lizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered car-tilage in the shape of a human ear J.Plast Reconstr Surg，1997;100（2）:297-302. 7Cao YL，Angela Rodiguez，Martin Vacanti，Clemente Ibarra，Car-los Arevalo，Charles A.Vacanti.Comparative study of the use of po-ly（glycolic acid） ，c
20、alcium alginate and pluronics in the tissue engineering of autologous porcine cartilage J.J Biomater Polymer，1998;9（5）:475-487. 8Derek SC，Peter EM，Butler，Cao YL，Rene Cas-anova，Mark A，Randolph，Ann Black，Charles A.Vacanti and Michael J.Yarem chuk，Tissue engineered neocartilage using plasma de-rived polymer substrates and chondrocytes J.Plast Reconstr Surg，1998;101（6）:1580-1585. 9Ronald P.Silverman，David Passanetti，Huang WY，Mark A.Randolph and Michael J.Yanemchuk，injectable tissue-engi-neered cartilage using a fibrin glue polymer J.Plast Reconstr Surg，1999;103（7）:1809-1818.
