1、缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶2 表达及活性水平的影响【摘要】 目的：探讨缺氧肝细胞对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶2(MMP2) 表达及其活性的影响。方法：缺氧培养肝细胞BRL3A( 氧浓度 5%)12 h后取其培养上清作为条件培养基,培养肝星状细胞 HSCT6, 设 6、12、24 h 3个时间点,RTPCR 、酶图法分别检测HSCT6 MMP2 mRNA表达及其酶活性。以无血清 DMEM培养肝星状细胞作为对照组。结果：随条件培养时间的延长,缺氧条件培养组 HSCT6 MMP2 活性均升高(30.748.22、31.718.10、49.7913.61),且高于对照组(18.581.62
2、、25.982.73、32.143.76),但扣除本底后缺氧条件培养基组 HSCT6 MMP2 活性(12.992.05、14.012.00、29.443.62)均低于相应对照组,在 6 h和 12 h时间点差异有统计学意义(P6 h=0.039,P12 h=0.007),缺氧条件培养基组 HSCT6 MMP2 mRNA表达量(0.440.07、3.661.10、4.290.99)高于相应对照组(0.610.07、2.500.27、0.520.16),差异具有统计学意义(P6 h=0.044,P24 h=0.030)。结论：物理缺氧条件下,肝细胞分泌或释放了可溶性物质作用于肝星状细胞，使其 M
3、MP2 表达上调,活性下降。肝细胞分泌或释放了何种物质尚待进一步研究。 【关键词】 基质金属蛋白酶2 ； 缺氧； 肝细胞； 肝星状细胞； 相互作用Abstract Objective：To investigate the effects of hypoxic hepatocytes on the expression and the activity of matrix metalloproteinase2(MMP2) in rat hepatic stellate cells.Methods： Hepatocytes (BRL3A) were cultured in Dulbeccos mo
4、dified eagle medium with 10% fetal calf serum at 37 and 5% CO2.When reaching confluence,the hepatocytes were incubated in serumfree medium and put into the hypoxiabox,in which the concentration of oxygen was 5%.After 12 h,the supernatants were harvested,and were used to culture rat hepatic stellate
5、cells (HSC cell line) for 6 h,12 h,24 h respectively.And then the supernatants and the cells were harvested.The expression of the MMP2 mRNA in HSC cells was detected by RTPCR.The activity of the MMP2 in the supernatant was detected by zymography.Results：The expression of MMP2 in the hypoxic conditio
6、nal groups at three time points (0.440.07,3.661.10,4.290.99) were higher than those in the control groups (0.610.07,2.500.27,0.520.16),P6 h=0.044,P24 h=0.030.However the activity of MMP2 in the hypoxic conditional groups (12.992.05,14.012.00,29.443.62) were lower than those in the control groups (18
7、.581.62,25.982.73,32.143.76),P6 h=0.039,P12 h=0.007.Conclusion：Hypoxic hepatocytes may secret some substances to promote MMP2 expression but depress the activity in hepatic stellate cells,and the effect correlated with the time.It is worth to studying further that what the substances are.Key words m
8、atrix metalloproteinase2; hypoxia; hepatocyte; hepatic stellate cell； cells crosstalk肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理学表现,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化过程中的关键环节。活化后的肝星状细胞分泌基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP2), 而MMP2 通过降解型胶原从而改变细胞外的基膜样基质而参与肝星状细胞活化和移行1 。氧作为细胞赖以生存所必需的营养物质,其供应异常显然将导致细胞功能紊乱。我们的前期研究2-4发现,物理性缺氧
9、和化学性缺氧都会影响 HSC MMP2 表达及酶活性。在肝脏缺氧状态下,作为肝脏主体细胞,同时也是 HSC的近邻肝细胞,是否调节 HSC表达MMP2 有待阐明。1 材料和方法1.1 肝细胞缺氧处理和 HSC缺氧条件培养大鼠肝细胞株 BRL3A( 购自中国科学院上海细胞库)和大鼠 HCS株HSCT6( 来源于美国 Friedman实验室)分别以 2105 ml-1细胞量接种于 6孔塑料培养板中,用含 10%优级胎牛血清的低糖 DMEM培养液培养于37 、体积分数为 5%的 CO2恒湿培养箱中。肝细胞铺满孔底 80%左右倾去完全培养基,PBS 冲洗 2遍后加入无血清低糖 DMEM,将培养板放入自制
10、缺氧盒内(容积 1 L),盒内通入氮气,测氧仪(上海雷磁新泾仪器有限公司,RSS5100 型)监测氧浓度,当氧浓度达到 5%时停止充氮气并密封缺氧盒。37 、恒湿培养箱中培养 12 h后,取其离心后培养上清作为缺氧条件培养基培养 HSC,分设 6、12、24 h 3个时间点,各时间点设 4复孔,将此 4孔作为缺氧条件培养基组；以无血清 DMEM培养 HSC作为对照组,每个时间点设 2复孔。在 37 、体积分数为 5%的 CO2恒湿培养箱中培养至设定时间收集上清，离心去沉渣,用透析袋浓缩蛋白并定量后作明胶酶谱检查,细胞用 Trizol reagent(购自 Invitrogen公司)处理,提取总
11、 RNA,检测 MMP2 mRNA表达。1.2 明胶酶谱法检测 MMP2 活性参照 Carney等5的方法,用含 1 mgml-1明胶(Sigma 公司产品)的 8% SDSPAGE 制备电泳板。条件培养基及其培养星状细胞后的培养上清、对照组上清,分别放入截留相对分子质量为 35的透析袋中,包埋于聚乙二醇中 40 min。上述浓缩后的上清蛋白定量后,取含 15 g 总蛋白的上清与加样缓冲液混合,并用加样缓冲液补齐上样。电压 100 V,电泳23 h,取出凝胶,用 Zymogram A buffer(北京普利莱基因技术有限公司)漂洗 2次,每次 1.5 h,Zymogram B buffer(北
12、京普利莱基因技术有限公司)孵育过夜,考马斯亮蓝(北京普利莱基因技术有限公司)染色 2 h,脱色至蓝色背景有透明条带出现为止。复日 Smart生物电泳图像分析仪扫描,进行密度分析。1.3 RTPCR 检测 MMP2 mRNA表达MMP2 、内参 Actin 引物由 Invitrogen公司合成。MMP2 引物：正义链为 5CATCGTACTCCTCGTTGCTG ATCCACAT3, 反义链为5CTCCCTCATGCCATCCTG CGTCTG3, 扩增片段长度为 228 bp。内参Actin 引物：正义链为 5CATCGTACTCCTGCTTGCTGATCCAC AT3, 反义链为 5CTCC
13、CTCATGCCATCCTGCGTCT G3, 扩增片段长度为 679 bp。用 Trizol reagent提取 HSCT6 总 RNA,取 1 g 进行逆转录。反应体系如下：RNAse free H2O 7.5 l,25 mmolL-1 MgCl2 4 l,10buffer 2 l,dNTP 2 l,Oliged T 1 l,AMV 1 l,RNAse inhibitor 0.5 l,RNA 1 g,补水至 20 l,30 反应 10 min,42 40 min,95 5 min；取 2 l 逆转录产物 ,依次加入 10buffer 2.5 l,上、下游引物各 1.5 l,5 Ul-1 T
14、qE 0.3 l,dNTP 2 l,加入灭菌的双蒸水至反应总体积为 25 l。MMP2 扩增反应条件：94 5 min,94 30 s,62.5 30 s,72 30 s,共 36个循环,72 延伸10 min；扩增产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,复日 Smart生物电泳图像分析仪扫描,进行密度分析和半定量比较,以每个标本的目的条带与该标本 actin 条带密度的比值作为该标本目的基因的相对表达量。1.4 统计学处理采用 SPSS 13.0软件作统计分析,数据用 x-s表示,组间比较用独立样本 t检验,P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 HSCT6 MMP2 活性改变随着
15、培养时间的延长,缺氧条件培养基组和对照组 HSCT6 产生的MMP2 活性均逐渐升高,但是扣除条件培养基内由肝细胞产生的 MMP2后发现(图 1、2),各时间点缺氧条件培养基组 MMP2 活性(12.992.05、14.012.00、29.443.62)均低于相应对照组(18.581.62、25.982.73、32.143.76),缺氧条件培养基组与对照组 6 h和 12 h时间点之间 HSCT6 MMP2 活性差异有统计学意义(P6 h=0.039,P12 h=0.007)。2.2 MMP2 mRNA表达随着时间的延长,缺氧条件培养基组和对照组 HSC MMP2 mRNA均表达增加(图 3、
16、4),各时间点条件培养基组的 MMP2 相对于内参actin 的灰度比值分别为 0.440.07、3.661.10、4.290.99,对照组为 0.610.07、2.500.27、0.520.16,缺氧条件培养基组和对照组 6 h和 24 h时间点之间 MMP2 mRNA表达差异有统计学意义(P6 h=0.044,P24 h=0.03)。3 讨论肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理过程,是肝脏的修复性反应,主要表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和降解失衡,合成的 ECM不仅量增多,其组分也发生了变化,型和型胶原纤维分泌增多,型胶原增多并且逐渐相互连接,沉积于肝
17、窦周围,使肝窦毛细血管化6 。而 MMP2( 又称明胶酶 A)作为主要降解型胶原的酶,主要由活化的 HSC分泌。MMP2 通过降解 ECM改变细胞周围的基膜样基质,又可以促进 HSC的活化,活化后的 HSC又分泌大量的 MMP2, 单从这一方面讲,二者是一个典型的正反馈过程。在肝纤维化过程中,型胶原的沉积提示MMP2 对其降解力度不够或酶的作用环境改变。显然,若在肝纤维化病程的不同阶段,人为干预该酶的表达和活性有可能延缓肝纤维化的发展,所以探明调节 MMP2 表达及活性的因素不论对该病的预防还是治疗均有十分重要的意义。氧是生命赖以生存的营养物质,其供应异常必然将导致细胞功能紊乱,肝脏感染和损伤
18、是肝脏缺氧的主要因素。体内研究结果提示,氧能通过调节HSC MMP2 表达及活性而影响肝纤维化的发展。在早期 MMP2 表达少、活性低,HSC 活化少,不利于肝纤维化的启动；而在纤维化形成期,MMP2活性高,有利于型胶原的降解和 HSC的活化。本组前期的体外实验证实,化学缺氧和物理缺氧均能使 HSC MMP2 mRNA表达上调,同时酶活性下降。缺氧诱导因子(hypoxia inducing factor 1,HIF1) 可能参与了缺氧条件下 MMP2 的表达调节。最近我们发现，纤维化肝组织表达 HIF1, 而且几乎全是纤维间隔附近肝细胞表达。提示作为肝脏的主体细胞以及 HSC的近邻肝细胞在氧对
19、 HSC MMP2 表达及活性调节中可能起重要作用。本实验从细胞间相互作用的角度来研究 MMP2 的表达和酶活性的变化,探讨肝细胞缺氧对 HSC MMP2 表达及活性的影响,结果发现其表达量随时间的延长逐渐增加,缺氧条件培养 12 h时达到高峰,24 h时下降,说明缺氧肝细胞条件培养基能够促进 HSC MMP2 mRNA表达,也就是说肝细胞在缺氧条件下分泌或释放了可溶性物质，并作用于 HSC使其 MMP2 转录增加,这种作用在 24 h内持续存在。酶谱显示缺氧条件培养基组MMP2 的活性反而下降,说明肝细胞缺氧时分泌某种物质,在 MMP2 翻译或者活性水平上作用于 HSC,使 MMP2 的活性
20、降低。作为肝脏的主体细胞、HSC 的近邻,肝细胞与 HSC的相互作用是十分复杂的7 。正常情况下肝细胞可以分泌许多细胞因子如TGF 、TNF 等；缺氧时 HIF1 等因子也表达增加。我们前期体外实验发现,物理缺氧和化学缺氧均能使 HSC MMP2 mRNA表达增加而活性下降。本研究结果表明,缺氧肝细胞也可以使 HSC产生同样的效应。由此可见,缺氧情况下,肝细胞及 HSC均能产生调控 MMP2 表达和活性的物质,且两种细胞产生的这些物质是相似的,因而有相同效应。目前已清楚,HIF1 是缺氧细胞所产生的关键转录因子,众多研究8证实，氧对细胞功能活动的调节与 HIF1 有关。肝细胞缺氧损伤后可能会有
21、活性氧自由基的释放,也可能有 HIF1 下游分子的表达释放,如胰岛素样生长因子、内皮素、瘦素、血管内皮生长因子等，甚至上清内离子浓度的改变均可能影响 HSCs MMP2 表达及酶活性。这些因子可以通过作用于 MMP2 的表达、翻译、修饰产生影响9 。也可能参与其中的不是单一的一种物质,可能是两种甚至两种以上的细胞因子的综合作用。这些物质是什么,通过什么途径作用于 HSC以及通过什么信号通路发挥作用值得进一步深入研究。【参考文献】1WYNN T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosisJ.J Pathol,2008,214(2)：199210
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