1、人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立及其生物学特性观察【摘要】 目的 建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。方法 采用人胃癌 SGC-7901 细胞株在裸鼠皮下经反复传 5 代形成实体瘤的完整组织块，建立人胃癌裸小鼠原位移植生长和转移模型 16 个。观察所建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常规 H-E 染色光镜下观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移情况。电镜下观察肿瘤超微结构及免疫组化 S-P 法检测肿瘤诱导型环氧化酶-2（COX-2） 。结果 胃癌裸鼠原位移植块再次原位移植的原位成瘤率达 100（16/16） ，淋巴结广泛转移率为 87.5
2、%（14/16） ，肝转移发生率为 75.0（12/16） ，腹腔积液形成率为 12.5%（2/16） 。结论 原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，具有人胃癌的生物学活性。 【关键词】 胃肿瘤 肿瘤细胞 原位移植 疾病模型 裸小鼠 Abstract： Objective To develop a nude mouse model of human gastric cancer that can mimic its natural human biologic activities. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 w
3、as cultured in nude mice repeatedly for 5 generations to get the subcutaneous solid tumor, which was then emulsified and orthotopicly inplanted into the anterior wall of the stomach in 16 nude mice. The tumor growth characters, tumor-take rate and metastatic rate were studied grossly, the transplant
4、ed tumor and its lymphatic and hepatic metastases, after routine H-E staining; the ultrastructures, by electron microscopy; and COX-2, by immunohistochemical method Results The tumor-take rate was 100（16/16）, the rates of metastasis to lymph nodes and liver were 87.5（14/16） and 75.0（12/16） respectiv
5、ely, the rate of ascites formation was 12.5%（2/16）. Conclusion The model of human stomach cancer established is qualified, exhibiting natural growth characters and biological activities. Key words: stomach neoplasms; orthotopic thansplantation; disease model; nude mouse 既往胃癌动物模型的建立多采用皮下接种方式，虽然这种移植方式
6、简单易行，肿瘤的生长情况也便于观察，且在一定程度上也近似地模拟了原有肿瘤的形态学、生物学及生物化学特性；然而接种于裸小鼠皮下组织毕竟属于异位移植，脱离了其起源组织器官的微环境，因此在实验中移植瘤的某些行为常不同于患者原发恶性肿瘤的生物学行为。如移植瘤常有包膜、局限性生长、很少发生局部或远处器官的转移，故未能很好地被应用于研究人癌潜在的侵袭与转移特性。我们选用低分化胃腺癌细胞系 SGC-7901 通过裸鼠皮下传 5 代后再原位移植建立的动物模型局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移，为胃癌的研究提供了一个很好的载体。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 BALB/C/nu/nu
7、裸小鼠由中科院国家啮齿类上海实验分中心购买，繁育自无特殊致病原 (special pathogen free， SPF)实验动物屏障环境。雌雄兼用，56 周，体重（172.5） g，分笼饲养（每笼 5 只） 。实验过程中均在 SPF 屏障环境内饲养。实验前 1 周购入小鼠，使之适应新环境。 1.1.2 瘤株 人胃腺癌 SGC-7901 细胞株，由中科院上海细胞生物研究所提供。癌细胞在含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液中，于 CO2 恒温孵育箱中培养，常规传代。 1.1.3 COX-2 羊抗人单克隆抗体及其免疫组化染色试剂盒购自苏州福佑生物技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1
8、人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立 1.2.1.1 皮下移植瘤模型的建立 收集体外培养的 SGC-7901 细胞，使细胞含量为 21010 个/L，取 0.1 ml 注入裸小鼠颈部皮下形成实体瘤。至肿瘤直径 1.5 cm 左右时，处死裸小鼠，切取肿瘤放入生理盐水（含105 U/L 青霉素和 105 U/L 链霉素）中，去除包膜，选择近边缘新鲜组织大约 1 mm3 以粗针穿刺接种于另一只小鼠，每次传代 4 只，反复传 5 代后作为原位移植用瘤源。 1.2.1.2 原位移植模型的建立 裸小鼠术前禁食 12 h，以 0.6戊巴比妥钠腹腔内注射（50 mg/kg）麻醉。常规消毒皮肤，取上述传 5 代后
9、生长 3 周左右处于对数生长期的荷瘤鼠，常规消毒，从颈部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成 1 mm1 mm1 mm 小块，以 8-0 丝线穿过浆肌层将上述一块瘤组织荷包缝扎在刮破浆膜的胃大弯前壁，荷包直径约 0.4 cm。分层关腹。术后精心饲养，每日观察 12 次，每周称 1 次体重。 1.2.2 光镜和电镜常规观察肿瘤形态学 1.2.3 免疫组化 S-P 法检测肿瘤组织诱导型环氧化酶-2（COX-2）表达判定标准 COX-2 表达阳性的判断以10%的肿瘤细胞的细胞质出现棕黄色颗粒者判断为阳性。 2 结 果 2.1 人胃癌组织块原位移植瘤的生长情
10、况 共建立供生长特性观察的原位移植模型鼠 16 只，成功率 100%（16/16） 。移植术后 34 周于左上腹部可扪及直径 23 mm 质地较硬的结节，随后肿瘤结节逐渐生长增大，57 周时上腹部可扪及较明显的肿块，同一组荷瘤鼠肿瘤结节的大小略有差异。810 周时，上腹部肿块的直径可达 1.01.5 cm，大部分动物消瘦明显，活动欠佳。以后瘤体继续增大，腹部可见巨大瘤体突起，动物极度消瘦、倦怠，对周围刺激反应差，逐渐出现全身衰竭和死亡。荷瘤鼠一般的生存时间为 1215 周，中位生存期 13.5 周。 2.2 大体解剖观察 打开腹腔去除胃周围组织可见（图 1）：看不到完整的胃壁，被肿瘤组织完全占
11、据，表面呈结节状，高低不平，触及质地较硬，切面均质、鱼肉状，瘤体较大时中央有坏死区。胃壁肿瘤与网膜粘连，部分动物瘤体与肝、脾及腹壁粘连，大部分动物腹腔内淋巴结肿大（图 2） ，部分荷瘤鼠肝脏中见有灰白色结节，少数动物腹腔内有少量腹腔积液。 2.3 光镜下观察 光镜下胃移植瘤细胞多呈椭圆形、核大、畸形、深染。瘤细胞排列呈巢状或索状，无明显腺体结构存在，在胃壁中呈浸润性生长（图 3） 。转移淋巴结内被癌细胞所充填，并破坏其组织结构，发展成转移癌结节（图 4） 。肝转移癌灶的组织学形态结构与胃移植瘤相一致，多在肝实质的血管周围形成，部分转移癌灶的瘤细胞在肝组织中呈浸润性生长，且已经形成自身的较粗的血
12、管系统（图 5） 。 2.4 透射电镜下观察 透射电镜下可见微绒毛突入细胞间隙，在许多紧密连接的细胞间能找到紧密连接、桥粒和缝隙连接。细胞内细胞器很丰富，以线粒体、粗面内质网、游离核糖体为多（图 6） 。 2.5 COX-2 表达情况 免疫组织化学染色结果表明：用人弥漫型胃癌细胞株 SGC-7901（低分化胃腺癌）细胞建立的人胃癌裸鼠原位移植瘤均高表达 COX-2，其阳性染色为棕黄色，定位于细胞质，无胞核着色（图7） 。 3 讨 论 理想的胃癌裸小鼠人类肿瘤动物模型是研究肿瘤生长和转移生物学以及寻求抗癌新药和新方法的重要工具。这些模型必须能够很好地模拟人体内肿瘤的生物学行为。一个很好的胃癌动物
13、模型应该具备肿瘤在局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移以及微转移的存在的条件1 。要建立能很好地模拟人类肿瘤恶性生物学行为的移植模型，必须使用具有转移潜能的瘤细胞，还必须让其在相应的器官环境中生长。 既往的胃癌模型建立常规采用的方法为在裸小鼠皮下植入人肿瘤细胞，生长出来的肿瘤组织在形态、功能、生化特征等方面与人胃癌十分相似，但因其周围有结缔组织包裹，即便是选用高转移性的肿瘤也仅仅形成局部肿瘤，限制了其浸润及转移2 。以后的研究发现，移植瘤是否能够发生转移，不仅取决于瘤细胞本身的转移潜能，还决定于宿主器官对应的环境因素，裸鼠体内特定的解剖部位所提供的微环境对肿瘤细胞的生物学行为有重要的影响，而
14、且肿瘤细胞和宿主微环境的相互影响对转移过程的完成起着举足轻重的作用3 。1889 年 Paget 提出“种子与土壤”学说（seed and soil hypothesis） ，认为只有种子（瘤细胞）与土壤（患者器官微环境）相互作用才可能产生转移瘤。越来越多的学者认识到肿瘤生长和亲器官性转移位点的微环境对于转移链的各个环节均有不同程度的影响。因而提出建立人类肿瘤模型的原位移植（orthotopic transplantation） 2：即将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植到动物体内相应的器官，使其获得与人体肿瘤相似的微环境。这一原位移植方式克服了上述所提到的异位移植存在的一些缺点。经过细致的观察发现：
15、裸鼠的原位移植颇似临床肿瘤的生长和转移特点，但其生长速度、生长动力学和转移率高低各不相同，这可能取决于不同的肿瘤类型和细胞的生物学行为的不同2，4-6 。 Furukawa 等4发现细胞悬液原位种植后，局部成瘤率和转移发生率较皮下移植块原位移植法低，且生长较皮下移植块法慢 23 周。本实验应用经裸鼠皮下反复传代的组织块移植于裸鼠胃壁，成功建立了 16个人胃癌原位移植模型，并观察了小鼠的自然生长过程。实验结果表明：皮下组织块原位移植建立的模型，局部成瘤率达 100，对濒临死亡的裸小鼠进行解剖观察发现，腹腔均发生广泛转移，且肝脏转移率达 75%。细胞悬液法可能是肿瘤细胞经酶消化处理后，细胞表面结构
16、遭破坏而发生变化，导致了恶性肿瘤生物学行为和自然属性的改变，结果影响了肿瘤细胞的生长和转移4，5 。皮下移植块原位移植的模型淋巴结转移较广泛，肝脏转移的发生率也较高。这可能是皮下传代的肿瘤细胞更能适应胃壁的生长环境，从而对其侵袭和转移等生物学行为的影响也最小，就如“在同样的土壤上原位移植块是最优秀的种子，就能结出最好的果实” 。本实验的原位移植胃癌模型在光镜、电镜下超微结构的观察结果表明和人胃癌的特点很相似。 COX-2 在胃癌、结肠癌等消化道肿瘤中均有过度表达，并在肿瘤的发生、发展中起着重要作用7，8 。本实验模型 COX-2 均高表达，很好地继承了人胃癌的生物学行为。 因此，我们认为皮下移
17、植块原位移植法具有成瘤率较高、淋巴结转移较广泛、肝脏转移发生率较高等特点，重现了人胃癌的临床病理和生理过程。该模型的建立为人胃癌转移机制与抗转移治疗的研究提供了一种有价值的工具。 【参考文献】 1 Illert B， Otto C， Braendlein S， et al. Optimization of a metastasizing human gastric cancer model in nude mice J. Microsurgery，2003，23(5):508-512. 2 Fidler IJ. Critical factors in the biology of human
18、cancer metastasis: twenty-eight GHA Clowes memorial award lecture J. Cancer Res，1990，50(19):6130-6138. 3 Killion JJ， Radinsky R， Fidler IJ. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice J. Cancer Metastasis Rev，1998-1999，17(3):279-284. 4 Furukawa T， Fu X， Kubota
19、 T， et al. Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue J. Cancer Res，1993，53(5):1204-1208. 5 Fujihara T， Sawaka T， Hirakawa K， et al. Establishment of lymph node metastatic model for human gastric cancer in nude mice
20、and analysis of factors associated with metastases J. Clin Exp Metastasis，1998，16(4):389-398. 6 Matsuoka T， Yashiro M， Sawada T， et al. Effect of a matrix metalloproteinase inhibitor on a lymph node metastatic model of gastric cancer cells passaged by orthotopic implantation J. J Exp Clin Cancer Res
21、，2001，20(2):213-218. 7 Chun KS， Surh YJ. Signal transduction pathways regulation cyclooxygenase-2 expression potential molecular targets for chemoprevention J. Biochem Phamacol，2004，68(6):1089-1100. 8 Marks F， Frstenberger G. Cancer chemoprevention through interruption of multistage carcinogenesis. The lessons learnt by comparing mouse skin carcinogenesis and human large bowel cancer J. Eur J Cancer，2000，36(3):314-329.
