1、原发性肝癌的基因治疗进展Progress of gene therapy in PHC汤 勇，周训平，王晓芹 （第三军医大学药学院药理教研室，重庆 400038）关键词 原发性肝癌；基因治疗；RNA 干扰 中图分类号 R 文献标识码 B 文章编号 1672-5042(2009)03-0000-00基金项目 第三军医大学训练部创新基金（2008）收稿日期 2009-01-20 修回日期 2009-02-16原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是常见的恶性肿瘤之一。目前对 PHC 主要治疗方法有手术治疗、放疗、化疗以及综合治疗等，然而治疗效果并不理想。随着分子生
2、物学和免疫学技术的发展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正和置换，即将缺陷基因的异常序列进行校正，对缺陷基因行精确的原位修复；另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的非定点整合，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能，达到治疗目的的一种方法。本文就原发性肝癌的基因治疗进展综述如下。1 反义基因治疗肝癌的发生、发展过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，应用反义核酸在转录水平和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以期阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。反义基因包括反义 RNA、反义 D
3、NA 和核酶 3 类。根据碱基互补的原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因表达，或利用核酶与相应的 mRNA 结合使其降解，均可达到基因治疗的目的。Wang 等 1利用 AFP 反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的 SMMC-7721 肝癌模型取得了明显的抗癌作用，减少了 AFP 的表达，抑制 SMMC-7721 细胞的增生。有研究显示 2，引用反义胰岛素养生长因子(Insulingrowth factor I，IGF-I) 寡核苷酸转染人肝癌细胞，发现肝癌细胞的凋亡阳性指数明显增加，并且被转染的癌细胞的 CEA 和 AFP 的分泌下降，表明反义 IGF-I 寡核苷酸可以抑制肝
4、癌细胞的增殖、促进分化并诱导肿瘤细胞的凋亡。2 自杀基因治疗某些病毒、细菌等原核生物含有一类基因，其编码的酶能将原来无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞，这类基因称为“自杀基因” 。这种特有的转换酶基因-自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞，近年来显示出良好的应用前景。目前常用针对肝癌基因治疗的有单纯病毒型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系(HSV-TK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5 氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系统。有研究表明 3，将“自杀基因”单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidin
5、e Kinease，HSV-TK)转染肿瘤组织，则该细胞的 HSV-TK 将前体药Gancyclovir(GCV)转化为对分裂细胞有杀伤作用的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞，对肝细胞肝癌在体外有一定的疗效。Won 等 4通过单纯疱疹病毒将 AFP 反转剪接靶 RNA 构成酶导入肝癌细胞，取代 HCC 高效表达 AFP 的 RNA 残基，结果明显延缓肿瘤细胞生长并降低了细胞中表达 AFP 的 RNA 水平。3 免疫基因治疗免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治疗、免疫刺激性因子免疫治疗、共刺激分子免疫治疗、活化的淋巴细胞进行过继免疫治疗、DC
6、 为基础的免疫治疗。基因疫苗指的是 DNA 疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。DC 是体内最强专职抗原递呈细胞，能有效刺激静息的细胞，诱发初次免疫应答，还具有发动和调节抗肿瘤免疫反应的特性。薛刚等 5应用 IFN 修饰的 DC 刺激 T 淋巴细胞，发现 IFN-DC 可促进 T 细胞增殖，并诱导 T细胞向 Th1 分化。IFN 的修饰可明显增强肝癌细胞抗原负载的 DC 所活化的 T 细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于 IFN 的修饰能促进 DC 成熟，增强 DC 促进 T 淋巴细胞增殖的作
7、用，诱导细胞免疫，增强 T 细胞的细胞毒作用，使 T 细胞能有效地杀伤肿瘤细胞.将 VEGFR 和 Tie 基因共同转染 DC，不仅活化了特异性CTL，还可以阻止肿瘤新生血管生成，从而将肿瘤免疫治疗和抗肿瘤新生血管生成治疗有效结合起来 6。 4 抑癌基因治疗到目前为止发现的抑癌基因有 p53，转甲状腺基因及其他抗癌基因和 N-ras，C-myc，Cest-2，IGF-R 以及 CSF-1 等，在所有的抑癌基因中 p53 基因的突变率较高，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及转化的概率。通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌基因的功能，从而抑制肿瘤的生
8、长和转移，常用野生型 p53、p16 等。p53 基因的突变或者失活不仅使细胞本身周期失调具有致瘤性，并且可以影响细胞对其他凋亡信号如 TGF 的感受性下降。穆红等 7使用p53-cDNA 的真核表达质粒 p53-pcDNA3 对人源性肝癌细胞系 HepG2 进行转染，采用 RNA 原位杂交的方法证明了外源 p53-cDNA 在 HepG2-p53 细胞中的转染和转录，成功导入的 p53-cDNA 可诱导 HepG2 细胞发生凋亡。p16 基因也为抑癌基因，原发性肝癌中 p16 基因也常表现失活，p16 基因能阻抑细胞生长于 G1-S 期，但不诱发凋亡。p16 启动子甲基化后，肝癌发生概率明显
9、提高，尤其对于 HBV 感染者。5 抗血管生成基因治疗肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的结果。肿瘤血管生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞，如巨噬细胞或肥大细胞产生的促血管形成因子所介导的。恶性肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，为了不断地获得氧和养料，肿瘤细胞就要不断的分泌促血管形成因子，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，因此，抑制肿瘤血管形成可以导致肝癌细胞衰退。肿瘤血管生成中最主要的是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。有试验表明 8，用脂质体法转然反义 RNA 对抗血管内皮生长因子，能够抑制裸鼠的种植性肝癌的生长。6 RNA 干扰技术的应用RNA
10、 干扰(RNA interference，RNAi)技术，也称为基因沉寂疗法，是利用双链 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发对宿主细胞特异性 RNA 转录的抑制，从抑制特异的基因表达的方法。利用 RNAi 技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。体外 RNA 干扰技术的主要特点在于其能利用细胞本身的成分，使外源重组干扰片断能持续转录，同时能以一种类似酶促方式对目标 mRNA 进行切割，从而形成高效、稳定而持久的干扰效应。尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，参与机体的多种生理和病理过程，其表达水平
11、与患者的生存呈负相关。李华等9构建针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因 siRNA 真核表达载体 pLXSN-EGFP-U6-siTERT，以 hTERT siRNA逆转录病毒为表达载体，感染 HepG2 细胞 24、48、72 h 后，端粒酶活性分别下降了 23.84%、58.03%和85.01%( P0.05)，感染后 24h 细胞凋亡 29.05%，肝癌细胞生长受到抑制，并存在一定量效和时效关系。RNAi 还可用于研究与肿瘤细胞生长分化相关的信号传导通路，并通过干扰细胞信号传导途径中关键蛋白的表达，达到抑制肿瘤生长的作用，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的技术方法。除了上述介绍的六种比较经
12、典的基因治疗方法外，近年又出现了一些新的基因治疗方法。有专家设想利用超声/微气泡介导目的基因进入靶组织的靶胞内 11，可以达到靶向性、可控性转导基因治疗的目的，有望成为有实用价值的临床基因治疗技术。还有专家认为不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗 12，在增强机体抗肿瘤免疫能力同时直接杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤、防止转移及复发的目的。7 展望目前肝癌的基因治疗策略已有很大发展，具有广阔的应用前景，而早期临床证据和临床实验表明，基因作为一种药物有重要的地位，将来的发展方向主要集中在下列几方面：寻找转染效率高、基因容量高、毒性小的基因治疗载体。近年来，利用超声对
13、比剂微泡作为基因载体并用超声技术处理，提高转染率已取得成功 13-15；开发基因，实现可调控的基因转染系统，以期提高在肝癌组织中的表达阳性率，进行更加精确的基因治疗；设计更具靶向性和安全性的基因转运系统，寻找肝癌特异转录调控元件，从而使外源基因能够持续、稳定和特异表达，真正实现肝癌的基因治疗从动物实验转向临床应用，将是肝癌基因治疗的主要研究方向。尽管还存在很多需要解决的问题，但随着分子生物学及相关学科的发展，我们相信肝癌的基因治疗终将会广泛地应用于临床。参考文献1 Wang XW，Yuan JH，Zhang RG，et al.Antihepatoma effect of alpha-fetop
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