1、通肾汤对阿霉素肾病综合征大鼠肾小球基底膜的影响作者：章文平，王桦，胡小瑛，江英能，宋国维 【关键词】 通肾汤 摘要：【目的】探讨通肾汤治疗肾病综合征的作用机理。 【方法】采用阿霉素肾病综合征大鼠模型及多聚亚胺染色方法，检测肾小球基底膜(GBM)上的阴离子位点数。 【结果】正常大鼠 GBM 上阴离子位点分布以外疏松层为主；阿霉素肾病综合征模型大鼠 GBM 上阴离子位点较正常组减少(001)，外疏松层减少更为明显；通肾汤能够使 GBM 阴离子位点恢复正常，与阿霉素肾病综合征大鼠模型组比较具有显著性差异(005)，与强的松比较无显著性差异(005)；两药合用作用更明显。 【结论】通肾汤能保护肾小球滤
2、过膜的电荷屏障，其治疗肾病综合征的作用可能与此有关。 关键词：肾病综合征/中药疗法；基底膜/超微结构；通肾汤/治疗应用； 疾病模型，动物；大鼠 通肾汤为治疗儿童肾病综合征的有效方剂，由黄芪、丹参、桃仁、川芎组成，原名为益气活血剂。既往的研究证实，该方能改善血液流变学、抗自由基、减少尿蛋白，具有确切的治疗效果 。为进一步了解通肾汤对阿霉素肾病综合征大鼠模型肾小球基底膜电荷屏障的影响，我们进行了以下实验，现将结果报道如下。 1 材料和方法 11 药物及试剂 通肾汤由广州中医药大学第一附属医院制剂室将黄芪、丹参、桃仁、川芎(3322)制备成水煎剂，含生药 3?g/mL，置冰箱备用；将通肾汤按照儿童剂
3、量的 125 倍即 25?g/kg 给予大鼠；强的松片(5?mg/片，浙江仙居制药有限公司出品，批号：030401)，按照小儿剂量 125 倍即25?mg/kg 给予大鼠；阿霉素(10?mg/支，深圳万乐药业有限公司出品，批号：0305E1)；多聚亚胺(Sigma 公司出品，批号：27FD041)；锇酸(TEBCHEM 公司出品，批号：00100180605004)。 12 动物分组、造模及给药 选用健康 SD 大鼠 40 只，雄性，体重(10010)g，普通级，由广州中医药大学实验动物中心提供，粤检证号：2001A056；随机分为正常组、阿霉素肾病模型组(模型组)、激素组、通肾汤组、激素+通
4、肾汤组，每组各 8 只；除正常组外的动物均按文献方法造模 ，即于大鼠尾静脉以75?mg/kg 一次性注射阿霉素溶液；肾病模型造模成功后，正常组、模型组以 2?mL/d 蒸馏水灌胃 1 次，激素组、通肾汤组、激素+通肾汤组按上述剂量灌胃，1 次/d。1 个月后测观察指标。 13 观察指标及测定方法 肾小球基底膜(GBM)上阴离子位点数采用多聚亚胺(PEI)染色方法进行检测。经大鼠尾静脉 1 次注射分子量为 40?00060?000 道尔顿、浓度为 10?g/L 的 PEI 溶液 1?mL(用生理盐水配制，并用盐酸将 pH 调至74)，25?min 后处死动物，取肾脏标本，用 01?mol/L、p
5、H 74 的二甲胂酸盐缓冲液冲洗后，置于 25?g/L 戊二醛20?g/L 磷钨酸固定液中固定 2?h以上，再次用二甲胂酸盐冲洗后，10?g/L 锇酸后固定，固定后的标本送电镜检查。每组标本观察 3 个肾小球，在 5 万倍放大的情况下拍摄 30 个GBM 节段，计数时只用 GBM 平直的片段，从测定的 GBM 长度和计数的阴离子位点数，计算出平均每 1?m GBM 内、外疏松层的阴离子位点数。 14 统计方法 各组数据以(s)表示，组间差异用 t 检验。 2 结果 表 1 及图 1 表明，正常大鼠 GBM 上阴离子位点分布以外疏松层为主；模型组 GBM 上阴离子位点数较正常组减少(001)；通
6、肾汤组阴离子位点数恢复正常，与模型组比较有显著性差异(005)；与强的松合用作用更明显。表 1 各组 GMB 上内、外疏松层阴离子位点数检测结果（略） 3 讨论 肾脏的电荷屏障是由肾小球的多阴离子(GPA)及肾小球基底膜(GBM)上的阴离子位点两部分组成。GPA 的主要成分是位于肾小球上皮细胞及内皮细胞表面的涎糖蛋白，带阴电荷成分主要是涎酸；GBM 上的阴离子位点则由内、外疏松层的疏酸类肝素蛋白多糖(HSPG)组成，带阴电荷的成分主要是 HSPG 上的疏酸基团及多聚羧酸盐群。 Mahan 的研究发现，微小病变型肾病综合患者 GBM 外疏松层的阴离子位点明显低于正常人，在大量蛋白尿时阴离子位点几
7、乎消失，经类固醇治疗达到缓解时，阴离子位点又在 GBM 外疏松层出现 。黄清明等用清除法亦得到类似结果 。我们的实验发现，正常大鼠肾小球 GBM 上阴离子位点分布以外疏松层为主，阿霉素(ADR)肾病综合征模型的 GBM 阴离子位点较正常组减少(001)，外疏松层减少更为明显，与文献报道结果一致， 。阿霉素能与 DNA 形成一种复合物抑制 DNA 和 RNA 的合成 ，这种复合物又是通过羧基的还原而代谢的 ，代谢产物氧化后形成活性氧类，活性氧可直接损伤脂膜，或刺激转录因子 NFkB 介导某些炎性细胞因子(TNFa，IL1，IL6)的基因表达 。因此，阿霉素及其代谢产物直接损伤足细胞或使足细胞代谢
8、紊乱，造成足细胞的形态学及基底膜中阴离子位点改变，从而使肾小球滤过膜的分子屏障和电荷屏障受损，导致蛋白尿的发生。 肾病综合征属中医水肿病阴水范畴，肺脾肾功能失调是其主要的发病机理。肾病综合征病程迁延，反复难愈。现代医学亦证实由于高脂血症、应用激素等因素，肾病综合征始终伴有高凝状态。高凝状态易使肾功能下降，严重影响治疗效果；且中医认为，气血同源，气能行水，血水互根，且病久多瘀，按照中西医结合理论及中医微观辨证理论，可认为肾病综合征过程中大都伴有气虚、血瘀、水停之证。 通肾汤为益气活血化瘀的代表方剂，它针对肾病综合征始终存在的高凝状态，而确立组成药物，适用于肾病综合征的整个发病过程。本方寓意益气、
9、活血，以达行水之目的。方以黄芪补气升阳，利水消肿，为君药；丹参养血活血，为臣药；川芎活血化瘀，行气止痛，桃仁活血化瘀，共为佐使药。四药合用能使气充、血旺、水行。临床及实验研究均证实，该方能够改善血液流变学、抗自由基、减少尿蛋白，具有确切的治疗效果， 。 研究表明，黄芪能改善肾病实验大鼠蛋白质代谢紊乱 ，改善脂代谢紊乱 ，亦具有辅助糖皮质激素治疗的作用 ，能从多个途径影响肾病综合征的预后；丹参能减轻原发性肾病综合征肾组织的损害，且无不良反应 。本实验结果亦证实，通肾汤能影响阿霉素肾病综合征大鼠模型肾小球基底膜电荷屏障，具有使肾小球阴离子位点恢复正常的作用，与强的松比较无显著性差异，两药合用具有协
10、同作用，有利于病变的恢复。因此，通肾汤在治疗肾病综合征显示出一定的优势，值得进一步研究。 参考文献： 章文平，宋国维，谢瑞珍，等益气活血剂对阿霉素肾病模型的影响 广州中医药大学学报，2000，17(2)：155 章文平，胡小英，宋国维，等益气活血剂治疗小儿肾病综合症的临床研究 新中医，2001，33(2)：31 Bertani T,Poggi A,Pozzoni R,et al.Adriamycininduced nephrotic syndrome in rats Lab Invest,1982,46:16. Pilia P A,Swain R P,Willians A V,et al.Gl
11、omerular anionic sites distribution in nonproteinuric rats:a computerassisted morphometic analysis Am J Pathol,1985,121(3)：474. Mahan D J,Sibley R K,Mauer S U,et al.A clinicopathologic study of fortyeight infants with nephrotic syndrome Kidney Int,1985，27:544. 黄清明，陈述牧清除法检测肾病综合症患儿肾小球电荷屏障的变化 中华肾脏病杂志，2
12、000，16(1)：38 白丽君，刘利平，陈重义肝素对阿霉素肾病大鼠肾小球系膜阴离子位点的影响 湖北医科大学学报，1997，2：123 张悦，魏民，王谦阿霉素复制大鼠微小病变肾病模型的研究 北京中医药大学学报，2002，25(2)：16 Bertolatus J A,Klinzman D,Bornma D A,et alEvaluation of the role of reactive oxygen species in doxorubicin hydrochloride nephrosis J Lab Clin Med,1991,118:435. Mross K,Mayer U,Hamm
13、K,et al.Pharmacokinetics and metabolism of iododoxorubicin and doxorubicin in humans Eur J Clin Pharmacol,1990,39:507. Schreck R,Baeuerle P AA role for oxygen radicals as second messengers Trends Cell Biol,1991,1:39. 李丽英，陈孟华，童坦君核转录活性测定法研究黄芪当归及单组分对肾病鼠白蛋白基因的调控机制 中华肾脏病杂志，1997，13(1)：25 愈雷，李惊子，洪健美黄芪当归合剂降低肾病综合征大鼠血脂机制的探讨 中华肾脏病杂志，1999，15(6)：337 于力，卓美瑛，杨小苏黄芪注射液对肾病综合征细胞因子及其基因表达的影响 中国中西医结合肾病杂志，2001，2(9)：523 鲍华英，余惠兰，王霖丹参注射液对原发性肾病综合征患儿血浆内皮素和可溶性白介素-2 受体的影响 中国中西医结合杂志，2001，22(1)：28
