1、外源核苷酸多代发育安全性评价作者：马奕 徐琳琳 许雅君 李勇【摘要】 目的 通过三代繁殖试验，观察外源性核苷酸对于啮齿类大鼠生育能力和后代生理、神经指标发育的影响，从而做出发育安全性评价。 方法 SD 大鼠(F0 代)断乳后，喂核苷酸，含量分别为 0、0.01 %、0.04 %、0.16 %、0.64 %、1.28 %的受试物饲料 90 d 后雌、雄 11交配，所产仔鼠为 Fl;Fl 断乳后喂养 90 d 后进行二代繁殖试验。重复上述实验方法直到多代繁殖实验结束，F3 代出生;期间观察各亲代大鼠孕期、分娩、哺乳期情况和各子代哺乳期情况、生理发育指标、神经反射指标。结果 外源补充核苷酸并未使亲代
2、大鼠的孕期、分娩、哺乳期以及子代大鼠的哺乳期、生理和神经发育反射出现异常情况。 结论 在本实验剂量下，补充外源补充核苷酸对于多代大鼠的生殖功能和胚胎期、胎儿期以及哺乳期的发育是安全的。 【关键词】 外源核苷酸;发育;安全性【Abstract】 Objective To investigate the effect of exogenous nucleotides on fertility in parents rats and the indexes of physiological and neural development in newborn rats over the three-
3、reproductive experiment, and evaluate the safety on development.MethodsWeanling rats (F0) were fed to exogenous nucleotides at the dose of 0, 0.01 %, 0.04 %, 0.16 %, 0.64 %, 1.28 % for 90 days and then male and female rats mated for 11 pattern. The offspring of F0 was F1. F1 rats were fed to exogeno
4、us nucleotides for 90 days after they were weaned. And then these rants go on to the second reproductive experiment. Repeat the progress above until F3 rats were born. In the whole period, we observed the gestational, partal, lactational period in parent rats and the lactational period and the index
5、es of physiological and neural development in newborn rats.ResultsNo abnormal situation was found among the gestational, partal, lactational period in parent rats and the lactational period and the indexes of physiological and neural development in newborn rats.ConclusionAt the dose of the experimen
6、t, supplementing exogenous nucleotides was safe to reproductive function and embryonic, fetal, lactational period in multi-generation rats.【Key words】 Exogenous nucleotides; Development; Safety近年来国内外大量研究资料日趋表明，外源核苷酸在特定生理条件下是不可缺少的营养成分，并视个体的生长发育阶段和特定的生理条件不同而有差异1。当动物受到免疫挑战、肝损伤、应激、饥饿及快速生长的情况下，外源核苷酸能进入各种
7、组织中并被吸收利用，将会节省机体从头或者补救合成的消耗从而可以优化组织功能。因此核苷酸被称为是一种“半必需”营养素或“条件”营养素。目前核苷酸添加剂广泛应用于婴幼儿配方奶粉中，添加了核苷酸的配方奶粉可以改善肠道菌群2，3，降低腹泻的发生率4，5，还可以激活肠道免疫,提高其天然杀伤细胞活性,从而增强对细菌感染抵抗力6。但目前没有文献说明对于普通正常婴幼儿补充外源核酸是否必要以及是否安全，而且缺乏对食用外源核苷酸婴幼儿生理发育指标和神经发育指标方面的研究，尤其是多代的发育安全性的研究更是空白。本研究就是通过多代繁殖试验，观察外源性核苷酸对于啮齿类大鼠生育能力和后代生理、神经行为指标发育的影响，从而
8、分析判断外源核苷酸是否对大鼠存在蓄积损害，进而作出发育安全性评价，旨在为核苷酸添加产品的开发提供科学理论依据。材料与方法一、材料1.实验动物及剂量分组：健康断乳 SPF 级 SD 种大鼠雌雄各 60 只，由北京大学医学部实验动物中心提供，动物合格证号，SCXK(京)20060008 。饲养在 SPF 级动物室(动物实验环境设施(SPF)合格证书，医动字第 012055), 饲养环境温度 2123,相对湿度 50 %60 %。以4 种核苷酸比例为5AMP5CMP5GMPNa25UMPNa2=22.825.830.220.4 的混合样品(由大连珍奥生物工程股份有限公司提供)添加到基础饲料中进行喂养
9、，各组饲料中核苷酸含量分别为 0.01 %、0.04 %、0.16 %、0.64 %、1.28 %。按照每天 10 g/100 g 体重的进食量计算，折合大鼠摄入量为每天 0.01、0.04、0.16、0.64、1.28 g/kg 体重，另设正常对照组，给予不添加核酸的基础饲料。期间各组动物自由进食、饮水。2.实验方法： SD 大鼠(F0)断乳后，喂含受试物饲料 90 d 后雌、雄 11 交配，所产仔鼠为 Fl(10 窝)。Fl 于出生后第 4 天调整到 8 只/窝，断乳后做 90 d 喂养试验，90 d 后进行二代繁殖试验。重复上述实验方法直到多代繁殖实验结束，F3 出生。3.检测内容及方法
10、：(1)亲代大鼠检测内容及方法。孕鼠孕期情况监测。孕鼠在受孕的 0、7、14 和 21 d 称重量体重和进食量，计算食物利用率;每天观察孕鼠有无烦躁、阴道流血、少食少动、嗜睡、行动不便等异常情况出现。孕鼠分娩情况。孕鼠临产时提供筑巢的垫料，保持分娩环境安静，观察分娩全过程，记录是否有难产、死产、畸形的发生，并避免母鼠不慎压死、压伤仔鼠。分娩结束后(哺乳 0 d)立即计数每窝仔鼠总只数，仔鼠雌、雄数目，死产数、活产数及肉眼可见的异常，并称量仔鼠窝重。 亲代母鼠哺乳期情况。观察整个哺乳期有无阴道流血、拒绝授乳、嗜咬仔鼠、乳头红肿、破溃或有非奶性分泌物等情况发生，在哺乳期 0、7、14 和 21 d
11、 称量母鼠体重和进食量，计算食物利用率。(2)子代大鼠检测内容及方法。子代生理发育指标检测。每天检查所有子代仔鼠，记录每窝仔鼠耳廓分离、门齿萌出(上牙)、睁眼、雌性阴道开放、雄性睾丸下降和包皮分离时间，将全窝 8 只仔鼠全部完成该生理指标发育的时间确定为该指标达标时间。子代神经反射发育指标检测。所有子代仔鼠，每天记录每窝仔鼠前肢定位反射、后肢定位反射、平面翻正反射、空中翻正反射、悬崖躲避反射和负向地性反射形成时间，将全窝 8 只仔鼠全部形成该反射的时间确定为该指标达标时间。子代哺乳期体重增长情况。分别于哺乳期的第 4、7、14、21 d 分别称取同窝雌、雄仔鼠的体重，比较各组仔鼠体重增长情况。
12、4.统计学处理：数据均采用 SPSS13.0 软件进行处理分析。方差齐的数据采用单因素方差分析(oneway ANOVA)与 Dunnettt 法进行分析，方差不齐的数据转换后用 Tamhanes T2 检验进行组间比较。之后汇总实验结果，整体评价产品的生殖发育安全性。结 果一、亲代大鼠检测结果1.孕鼠孕期情况：F0、F1、F2 代各组孕鼠整个孕期没有烦躁、阴道流血、少食少动、嗜睡、行动不便等异常情况出现，各组大鼠每周体重增长和食物利用率比较，差异无统计学意义(P0.05)。2.孕鼠分娩情况：F0 代各组孕鼠未出现流产、难产情况，后代除对照组出现 1 只右侧唇腭裂伴颅脑畸形(死产)外，其余剂量
13、组未出现形态畸形。F1、F2 代各组孕鼠未出现流产、难产及仔鼠畸形等情。F0、F1、F2 代仔鼠平均窝重、活产只数、仔鼠平均体重、性别比例，差异无统计学意义(P0.05)，见表 1。3.母鼠哺乳期情况:F0、F1、F2 代各组母鼠整个哺乳期无阴道流血、拒绝授乳、嗜咬仔鼠、乳头红肿、破溃或有非奶性分泌物等情况发生，孕期母鼠每周体重变化和食物利用率比较，差异均无统计学意义(P0.05)。二、子代大鼠检测结果1.生理指标发育情况：F1、F2、F3 代各剂量组生理发育指标与对照比较，差异均无统计学意义(P0.05)，见表 2。表 1 孕鼠分娩情况表 2 生理发育指标达标时间2.神经反射发育情况：F1、
14、F2、F3 代各剂量组神经反射指标与对照相比较，差异均无统计学意义(P0.05)，见表 3。表 3 神经反射指标达标时间3.子代哺乳期体重增长情况：F1、F2、F3 代整个哺乳期各组两种性别仔鼠体重增长比较，差异均无统计学意义(P0.05)。讨 论Uauy R7表明,母乳喂养的婴儿,所需的核苷酸约有 1/3 来自母乳,而代乳品喂养的婴儿所需核苷酸 95 %来自从头合成途径。奶粉中补充外源性核酸或母乳喂养,通过分散从头合成的代谢耗费,可优化组织的生长和分化,对于早产婴儿来说, 补充核苷酸的奶粉尤为重要,因为未足月的新生婴儿在许多代谢功能和接受母乳喂养的机会方面是有限的。因此一些国家陆续允许向婴儿
15、奶粉中添加核苷酸，我国卫生部也于 2005 年正式发布公告,允许在婴儿奶粉中添加核苷酸,添加量为 0.20.58 g/kg，但目前国内外对于核苷酸多代发育安全性的研究还是空白。本研究显示，在本实验剂量下，多代母鼠在孕期、分娩期和哺乳期以及仔鼠在胎儿期和哺乳期均未出现异常情况，因此外源性补充 4 种核苷酸对于多代大鼠的生殖功能和胚胎期、胎儿期、哺乳期的发育是安全的。这与已有的毒理学研究结果相符，赵超英等8采用大小鼠急性和亚慢性毒性试验和体内外致突变试验对某市售核酸产品进行了安全性评价，结果表明受试物对受试动物无急性及亚慢性毒性，对体细胞和生殖细胞无致突变作用，对基因无碱基对置换和移码突变作用，提
16、示其作为保健食品用于人体是安全的。盛少虎等9所做的核酸口服液急性毒性试验结果提示其最大耐受量在相当于成人用量 140 倍的剂量下无毒性反应。综上所述，通过多代繁殖实验发现，本实验剂量的外源核苷酸添加并未对后代大鼠造成近期或远期蓄积的生殖发育毒性损害，外源补充核苷酸对于多代大鼠的生殖功能和胚胎期、胎儿期以及哺乳期的发育是安全的。这一结论对于将核苷酸添加到婴幼儿奶粉或其他食品中有重要意义，这将为核苷酸食品的开发提供理论依据。对于核苷酸多代生殖发育安全性的研究，本研究室也将继续进行，以得到更可靠、更全面的安全性评价。【参考文献】1 汪余勤.核苷酸与营养J.国外医学卫生学分册，1999,26 (5):
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18、ion. 2008, 87 (6):17851792.4Yau KI, Huang CB, Chen W, et al. Effect of nucleotides on diarrhea and immune responses in healthy term infants in TaiwanJ. J Pediatr Gastroenterol Nutrion,2003,36(1):3743.5Arnaud A, pezPedrosa JM, Torres MI, et al.Dietary nucleotides modulate mitochondrial function of in
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