1、维生素 E 对糖尿病大鼠高级糖基化终末产物及其受体和肾功的影响【摘要】 目的 观察维生素 E对糖尿病大鼠高级糖基化终末产物(AGEs)及其受体(RAGE)和肾功能的影响。方法 利用链脲佐菌素腹腔注射法诱导建立糖尿病大鼠模型。将实验用 SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM 组)和维生素 E治疗组(VE 组)，治疗 8周。观察大鼠的一般状况，监测血糖(BGL)、糖化血红蛋白(HbA1C)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、内生肌酐清除率(Ccr)、尿白蛋白排泄率(UAER)、肾重/体重比值；应用荧光显微镜观察肾脏组织 AGEs，免疫组化方法检测 RAGE含量。结果 与 NC组比较
2、，DM 组大鼠体重、血糖、HbA1C、BUN、UAER、肾重/体重比值均明显增高(P0.01)，Ccr 明显下降(P0.01)，肾脏AGEs及 RAGE含量均明显增高(P0.01)；与 DM组相比，VE 组UAER、肾重/体重比值明显降低(P0.05)，Ccr 明显升高(P0.01)，肾脏 AGEs及 RAGE含量均明显降低(P0.05)。结论 维生素 E无降糖作用，但可能通过减轻糖尿病大鼠肾组织的非酶糖基化过程，从而减轻AGEs与受体结合后导致的对肾脏组织的损伤，对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。 【关键词】 高级糖基化终末产物 高级糖基化终末产物受体 维生素 E 糖尿病肾病ABSTRACT:
3、Objective To observe the effect of Vitamin E on advanced glycosylation endproducts (AGEs) and their receptors in renal tissue of diabetic rats. Methods Rat diabetic nephropathy was induced by intraperitoneal injection of STZ. Rats were allocated to normal control group (NC group), diabetes mellitus
4、group (DM group), and Vitamin E group (VE group). All rats were treated with corresponding drugs for 8 weeks. During and after the treatment, the general state, blood glucose level (BGL), blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), urinary albumin excretion rate (UAER), glycosylated hemoglobi
5、n (HbA1C), clearance rate of creatinine (Ccr) and kidney weight/body weight ratio were determined in different groups. The fluorescence microscope was used to observe advanced glycosylation endproducts fluorescence intensity in iced slices. The expression of RAGE in rats renal tissue slices was meas
6、ured by immunohistochemistry. Results Compared with those in NC group, GLU, HbA1C, BUN, UAER, kidney weight/body weight ratio, contents of AGEs, and RAGE increased significantly (P0.01), while Ccr decreased significantly (P0.01) in DM group. Compared with those in DM group, UAER, kidney weight/body
7、weight ratio, contents of AGEs, and RAGE decreased significantly (P0.05), while Ccr significantly (P0.05) increased in VE group. Conclusion Vitamin E has no effect in decreasing blood glucose level, but has a certain role in preventing renal function by alleviating the accumulation of advanced glyco
8、sylation endproducts.KEY WORDS: advanced glycosylation endproducts(AGEs); receptor for advanced glycation endproducts(RAGE); Vitamin E; diabetic nephropathy糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，是导致终末期肾疾病和 1、2 型糖尿病患者死亡和残疾的主要原因之一。研究证明在糖尿病持续高糖状态下，体内晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts, AGEs)的过量生成以及与细胞表面受体的结合在糖尿病慢性
9、并发症中起重要作用1。以往研究发现，维生素 E具有防治糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠肾脏病变的作用2，但对其是否通过影响非酶糖基化反应来发挥上述作用尚不清楚。本研究通过观察维生素 E对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾小球 AGEs及其受体(the receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)的表达情况，进一步了解维生素 E在治疗糖尿病肾病中的作用以及与糖基化终末产物之间的相关性，为糖尿病肾病的发病机制研究及临床治疗提供新的思路和启示。1 对象与方法1.1 糖尿病大鼠模型的建立及分组 将 50只 SD雄性大鼠(体重20
10、0g左右，由西安交通大学医学院实验动物中心提供)随机分为两组；正常对照组(NC 组)10 只，实验组 40只。链脲佐菌素(Sigma 公司)临用前以0.1mmol/L、pH 4.2的柠檬酸盐缓冲液(CB)溶解，新鲜配成 38mmol/L STZ溶液。实验组大鼠禁食 12h后给予链脲佐菌素 50mg/kg，单次腹腔注射；正常对照组注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液。72h 后取鼠尾微量血测定血糖，取血糖持续大于 16.7mmol/L、尿糖在() 以上者定为实验动物，确定糖尿病模型建立，小于 16.7mmol/L者剔除。将成模实验动物随机再分为糖尿病组(DM 组，18 只)和维生素 E治疗组(VE 组，
11、17 只)。1.2 给药方法 成模后每周监测大鼠的血糖和体重。所有糖尿病大鼠均根据其血糖水平皮下注射鱼精蛋白锌胰岛素 1-2u/d，将血糖控制在 16.7-25mmol/L范围内。两周后 VE组给予维生素 E 100mg/kg灌服，NC组和 DM组给予相同体积的生理盐水灌服，共 8周。所有大鼠分笼喂养，自由饮食，自然昼夜光线照明。1.3 标本采集 所有大鼠于 8周末分别置于代谢笼中，留取 24h尿液，用于检测尿白蛋白排泄率(UAER)和尿肌酐。以 80mmol/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后心脏取血 6mL，离心后取血清，用于测定糖化血红蛋白(HbA1C)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。然
12、后切取左肾，去掉被膜后称重，滤纸吸干血迹，置于 40g/L多聚甲醛溶液(0.1mmoL/L PBS，DEPC 水配制)固定，用于 RAGE免疫组化检测。切取右肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后迅速置于液氮中固定保存，用于 AGEs荧光测定。1.4 测定方法1.4.1 一般项目 血糖：氧化酶法，采用拜尔公司拜安易血糖仪及试纸条；Scr、BUN、尿肌酐：采用日立全自动生化仪测定；尿白蛋白定量：放免法，白蛋白放射免疫试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；GHbA1C：采用北京生物工程公司提供的糖化血红蛋白试剂盒，亲和层析法测定。1.4.2 大鼠肾脏组织病理学观察 肾组织常规固定、脱水、透明、石蜡包埋，制成
13、 3m 切片，常规脱蜡，PAS 染色，以 Imagepro 5.0进行病理分析，测量参数包括肾小球截面积和体积，每个肾脏标本随机测量20个肾小球，取其平均值。1.4.3 大鼠肾脏组织 AGEs测定 参照 Hammes等3的荧光显微镜曝光时间法。将液氮中的肾组织制成 3m 冰冻切片，用荧光显微镜观察。在 370nm入射光下，记录荧光显微镜的自动摄片设备所显示的曝光时间，以此间接反映肾组织的 AGEs含量。1.4.4 大鼠肾脏组织 RAGE测定 采用 SABC免疫组织化学染色技术，石蜡切片脱蜡后，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5min，高压 EDTA抗原修复；0.9mol/L H2O2室温孵育 10m
14、in，PBS 冲洗，滴加一抗兔抗鼠 RAGE多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)后 4过夜，PBS 冲洗后加生物素化二抗和辣根过氧化物酶、长链卵白素组成的三抗，形成 SABC复合物。在过氧化物酶的作用下，由 DAB显色剂显色。细胞内有棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。在光学显微镜下观察切片中的 RAGE在肾小球的表达分布。1.4.5 结果判定 采用 Motic Med 6.0数码医学图像分析系统A(厦门麦克奥迪有限责任公司)对染色强度定量分析。即每张切片随机抽取 5-10个视野，测定阳性细胞的平均吸光度值、积分吸光度值。采用每张切片测量值的平均值进行组间比较。1.5 统
15、计学处理 应用 SPSS13.0软件进行统计处理。结果以均数标准差(s)表示，两组间比较用独立样本 t检验，多组间比较采用方差分析和 CNKq 检验，相关分析采用线性相关分析，以 P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 三组大鼠一般情况的比较 NC组大鼠体重增加明显，精神状况良好，皮毛有光泽，动作自如，反应灵敏。DM 组大鼠逐渐出现了多饮、多尿、多食，消瘦(表 1)及精神萎靡、反应迟钝、毛发竖立无光泽、动作迟缓、倦卧拱背等症状，有 2只白内障。VE 组大鼠精神状况良好，无白内障及尾、足坏死，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差。在观察过程中，因感染、糖尿病酮症等原因死亡 5只，均予以剔除。2
16、.2 8 周末血、尿生化指标及肾功的检测 在病程 8周末时 VE组、DM组同 NC组比较血糖、BUN、Scr、HbA1C、UAER 及肾重/体重均明显升高，肌苷清除率(Ccr)明显下降。VE 组和 DM组比较 VE组 UAER、肾重/体重明显降低(P0.05)；UAER 明显升高(P0.01)，其余指标未见明显差别(表 2)。表 1 三组大鼠体重、肾重/体重、血糖及糖化血红蛋白的比较（略）Table 1 Comparison of weight, kidney weight/body weight, BGL, and HbA1C in 3group ratsNC: normal control
17、 group; DM: diabetes mellitus group; VE: Vitamin E group. *P0.05, *P0.01 vs. NC group; P0.05, P0.01 vs. DM group表 2 三组大鼠 BUN，Scr，UAER，Ccr 的比较（略）Table 2 Comparison of BUN, Scr, UAER, and Ccr in 3group ratsNC: normal control group; DM: diabetes mellitus group; VE: Vitamin E group*P0.05, *P0.01 vs. NC
18、group; P0.05, P0.01 vs. DM group2.3 大鼠肾脏形态学改变 光学显微镜下观察大鼠 8周末的肾组织形态学改变发现，NC 组大鼠肾小球及小管间质未见明显的病理改变；DM组大鼠肾小球明显增大，肾小球细胞增生，散在肾小管上皮细胞肿胀变性、脱落，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，系膜区增宽肾小球系膜区血管基质中度到重度增多及系膜细胞中度到重度增生，伴有间质散在的灶性炎症分布和淋巴细胞浸润，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，管腔狭窄，偶可见糖蛋白浸润所致的均质样(轻度玻璃样)改变；VE 组大鼠上述病理改变均有不同程度的减轻，间质炎症不明显。2.4 大鼠肾组织 AGEs的表达 NC组
19、大鼠肾组织中的 AGEs的荧光强度最低，而 DM组大鼠肾组织中的 AGEs的荧光强度最高，即曝光时间最短(P0.01)；VE 组虽比 NC组高但明显低于 DM组(P0.01)。2.5 大鼠肾组织 RAGE的表达 DM组大鼠肾小球中 RAGE染色阳性细胞率及吸光度值均比 NC组明显升高(P0.01)，而 VE组比 DM组肾小球阳性细胞率和吸光度值明显降低(P0.05，表 3、图 1)。表 3 RAGE在各组大鼠肾小球中的表达（略）Table 3 Expression of RAGE in 3group ratsNC: normal control group; DM: diabetes mell
20、itusgroup; VE: Vitamin E group. *P0.05, *P0.01 vs. NC group; P0.05, P0.01 vs. DM group图 1 三组大鼠肾组织中 RAGE的表达情况（略）Fig.1 Immunohistochemical analysis for RAGE expression in rat glomeruli (SABC 400)A: normal control group; B: diabetes mellitus group; C: Vitamin E group3 讨论大量研究结果表明,由持续高血糖所致的晚期糖基化终末产物(AGEs
21、)蓄积是引起糖尿病慢性并发症的关键因素4。糖尿病肾病患者血浆及硬化的肾小球中均有明显的 AGEs蓄积，后者本身及与相应的受体结合参与了肾脏病变的发生，并与病变过程密切相关。Suzuki 等5研究显示，在糖尿病肾病患者的肾组织中 AGEs及 RAGE表达上调。Yamamoto 等6发现，表达高水平 RAGE基因的小鼠于 4月龄时尿白蛋白排泄率明显高于正常小鼠。Wendt 等7将部分小鼠 RAGE基因敲除后用 STZ诱导糖尿病，12 周后 RAGE基因未敲除糖尿病小鼠的肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜基质增加，而 RAGE基因已敲除的糖尿病小鼠并无上述变化。以上研究均提示，RAGE在糖尿病慢性并发症
22、，尤其是糖尿病肾病的形成和发展中占有重要的地位。兔及大鼠注射 AGEs化的白蛋白 8周后，分别出现肾小球和肾小管肥大，以及广泛的肾小球和小动脉基膜增厚。本研究亦观察到 DM大鼠肾小球细胞内 AGEs、RAGE 表达均有明显升高，再次证明 AGERAGE 在糖尿病肾病发病中的作用。而维生素 E治疗组大鼠肾小球 AGEs、RAGE 的表达明显减少，提示维生素 E可以抑制肾脏非酶糖基化及其特异性受体的生成。由于维生素 E是体内重要的抗氧化剂，线粒体是高糖诱导产生活性氧簇(ROS)的主要部位，维生素 E可以降低线粒体中超氧化物的生成，同时通过稳定线粒体膜和清除已生成的超氧化物也可达到降低线粒体超氧化物
23、水平的目的8，在细胞抗氧化机制中起着关键的作用。多因素分析表明，氧化应激在生理或病理条件下可通过糖氧化、自身氧化等作用参与 AGEs的形成。先前已有研究者意识到 Maillard反应与氧化应激的复杂关系。最近 Brownlee9 提出了糖尿病并发症发病的统一机制学说，认为高血糖诱导细胞产生过量的 ROS是多元醇途径、AGEs途径、PKC 途径及己糖胺途径激活的一个共同上游事件。体外实验表明高血糖引起的 ROS升高可以使甘油醛3 磷酸脱氢酶(GAPDH)活性下降 66%10，导致糖酵解中间产物甘油醛3 磷酸显著增多，过多的磷酸丙糖转化为 AGEs的前体甲基乙二醛，使得 AGEs生成增加。另外，在
24、系膜细胞和内皮细胞，AGEs 与 RAGE相互作用亦可使胞浆内产生大量 ROS8。因此糖基化和氧化应激反应之间关系密切：氧化作用促进糖基化反应和 AGEs的形成，同时 AGEs的形成过程及其受体介导细胞效应又可产生自由基，引起氧化应激，两者可以形成恶性循环。本研究结果证明维生素 E对肾脏的保护作用主要是通过限制、清除机体内的活性氧，减轻氧化应激状态，进而抑制 AGEs的活性及形成，阻止糖尿病肾病的发生发展。尿白蛋白排泄(UAER)是糖尿病肾病(DN)诊断的金标准，减少 UAER可以延缓 DN的发生发展。本实验以 STZ制备糖尿病动物模型。在实验第 8周末,发现糖尿病组大鼠较正常对照组大鼠的 G
25、LU、HbA1C 水平均明显升高，符合糖尿病特征性的病理生理改变；而其肾重/体重比值和UAER、Scr、BUN 亦较正常对照组明显升高，Ccr 明显降低，提示糖尿病大鼠的肾脏已出现损害。本研究结果显示，糖尿病大鼠经维生素 E治疗后 UAER、Ccr 及病理改变等指标得到改善，这与相关文献报道一致。本研究亦证实维生素 E保护肾脏的作用不是通过降低血糖而发挥，主要来自其强大的抗氧化能力和抑制 AGEs产生。但维生素 E对糖尿病肾病的保护作用可能是多方面的，其确切机制及是否具有量效关系尚有待于进一步研究。【参考文献】1Martin B, Sybille F, Gunter W, et al. The
26、 advanced glycation end product N (epsilon)carboxymethyllysine is not a predictor of cardiovascular events and renal outcomes in patients type 2 diabetic kidney disease and hypertension J. Am J Kidney Dis, 2006, 48(4):571579.2Koya D, Lee IK, Ishii H, et al. Prevention of glomerular dysfunctions in diabetic rats by treatment of dtocopherol
