1、西藏小型猪 ESR 基因 Pvu多态性与生长繁殖性能相关分析作者：曾昭智 江涛 张锦红 顾为望 【摘要】 目的 了解 ESR基因 Pvu位点在西藏小型猪中的多态性分布情况；研究其在西藏小型猪上的遗传效应，为西藏小型猪生长繁殖性状的分子遗传标记辅助选择提供实验依据。方法 记录 44头西藏小型猪母猪繁殖性能，并对其所产仔猪的生长性能进行测定，采用PCRRFLP 方法对 ESR基因 Pvu位点进行多态性与生长繁殖性能进行相关性分析。结果 西藏小型猪 ESR候选基因 Pvu位点表现出多态性，为AA、AB、BB 型，A、B 等位基因频率特征。初产胎的产仔数在不同基因型间差异存在显著性，不同基因型间产仔数
2、呈 BBABAA的趋势，初产胎和经产胎的母猪其他指标在不同基因型间差异均没有显著性。结论 提高西藏小型猪猪群 ESR基因 Pvu位点 B等位基因频率，有利于提高西藏小型母猪的产仔数。 【关键词】 西藏小型猪 ESR 基因 多态性 生长繁殖性能 相关分析 Abstract:Objective To obtain the information on Pvupolymorphism distribution of ESR gene and study its genetic effect on Tibet minipigs to provide experimental evidence for
3、molecule genetic marker selection of growth and reproductive traits. Methods Growth and reproduction traits of 44 Tibet minipigs were recorded. The Pvu polymorphism of ESR gene was detected by PCRRFLP and the relationship between polymorphism and growth and reproduction performance was analyzed. Res
4、ults The genotypes were AA, AB, BB with A and B were alleles. TBN（total birth number）of the primiparous sows was significantly different between different genotypes and the tendency of TBN between different genotypes was BBABAA, other index between primiparous sows and parous sows showed no signific
5、ant difference. Conclusion The study results demonstrated that improving allele frequency of B allele of ESR gene might be helpful to improve TBN of Tibet minipigs. Key words:Tibet minipig ； ESR gene；Pvupolymorphisms；growth and reproduction traits； correlation analysis 近年来，对影响动物的经济性状(数量性状)主基因的研究成为遗传
6、学研究的热点之一。而产仔数作为一个重要的经济性状，更是研究的重点，近期对产仔数有显著或较显著关联的候选基因雌激素受体（ESR）基因和催乳素受体（PRLR）基因研究较为突出1 ，1991 年Rothschild2报道了猪 ESR位点的 Pvu 多态性，探讨过这种多态性与生长繁殖性能间的关系。 由于西藏小型猪是我国优良地方猪种，产于我国青藏高原，是典型的高原型放牧猪种3 ，很难收集到关于生产性能和繁殖性能的实验数据，故对西藏小型猪功能基因与生长繁殖性能的研究还未见报道。本研究对西藏小型猪 ESR基因的 Pvu位点多态性分析与生长繁殖性能进行相关性研究，研究其在西藏小型猪上的遗传效应，为进行生长繁殖
7、性状的分子标记辅助选择提供依据，以提高西藏小型猪的生长繁殖性能，也为实现我国特有小型猪资源西藏小型猪的选育保种、开发利用和实验动物化提供实验依据4 。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 样本来源 南方医科大学实验动物中心西藏小型猪基地随机抽取 44头西藏小型猪母猪采其耳组织样品，每头猪取一小块耳组织放入准备好的 EP管中，用冰盒带回实验室备用。 1.1.2 数据收集 收集了采样西藏小型猪母猪的初产和经产胎的产仔数、产活仔数和离乳成活数以及所产仔猪的初生体质量、离乳体质量（60 日龄体质量）等相关的生长繁殖数据。 1.2 试验方法 1.2.1 基因组 DNA的抽提 采西藏小型猪耳组织
8、块，切取 10 mg左右的动物组织材料，用试剂盒的方法提取基因组 DNA并用用 1%琼脂糖凝胶电泳检测， DNA 提好后保存在20 ，以防 DNA降解。 1.2.2 目的基因的扩增 引用 Short5设计的猪 ESR基因的引物：Forward primer：5CCTGTTTTT ACAGTGACTTTTACAGAG3 ，Reverse primer：5CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG3 ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增的特异性片断长度约为 120 bp,位于 ESR基因的第 5外显子。PCR 反应体系：10 PCR buffer（无 Mg2+）：2.5 L，Mg2
9、+（25 mmol/L）：1.5 L，dNTPs（10 mmol/L）：0.5 L，Primer 1（25 mmol/L）：0.05 L，Primer 2（25 mmol/L）：0.05 L，Template DNA：3.0 L，Taq 酶 (5 U/L)：0.5 L，去离子水：16.9 L，共 25 L。PCR 反应条件：94 预变性 3 min，然后进入如下循环(共 35个)：94 变性 1 min，58 退火 45 s，72 延伸 1 min。循环结束后，72 延伸 8 min。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否在所需的长度范围内以及是否有非特异带产生。 1.2.3 PCR扩增产物的
10、 RFLP分析及基因型判定 酶切反应体系：buffer：2.0 L，PCR 产物：10 L， Pvu II (10 U/L)：1 L，去离子水：17 L，在 37 水浴中酶切消化过夜，形成 3种基因型：AA基因型(120 bp/120 bp)，AB 基因型(120 bp/65 bp+55 bp), BB基因型(65 bp+55 bp/65 bp+55 bp)。由于酶切后片段的分子量相差不大，故采用 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酶切产物检测，用凝胶成像分析系统扫描记录电泳图谱，统计基因型。 1.2.4 统计分析 根据电泳结果统计基因型的个数及基因型频率以及各等位基因的基因频率。通过计算各基因座位
11、基因型的生长繁殖性能表型平均值，运用软件分析 SPSS10.0 for Windows中单向方差分析检测各基因型生长繁殖性能的差异。多组间两两比较用 LSD方法。 2 结果 2.1 PCR 扩增反应结果 PCR 扩增西藏小型猪雌激素受体基因所得产物片段为 120 bp，如图1。 118 示雌激素受体基因扩增产物，M 为 Marker(DL2000) 图 1 雌激素受体基因 PCR扩增产物电泳图（略） Figure 1 Electrophoresis pattern of PCR products of ESR gene 2.2 西藏小型猪 ESR基因 PCRRFLP 分析 扩增产物用限制性内切
12、酶 Pvu II消化，经过 12聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在凝胶成像系统照相后可观察到图 2所示的图像。 2.3 西藏小型猪 ESR基因型和基因频率统计 在本次所测的西藏小型猪中,基因位点同样出现了 3种基因型，其中ESR基因 AA型母猪有 12头，基因型频率为 0.273；AB 型母猪有 22头，基因型频率为 0.500，BB 型母猪有 10头，基因型频率为 0.227；其中 A等位基因频率为 0.523，B 等位基因频率为 0.477。 6 为纯合子 AA型； 5、7、8 为纯合子 BB型；1、2、3、4、9 为 AB型;M 为 Marker (DL500) 图 2 ESR基因 Pvu II酶
13、切产物电泳图（略） Figure 2 Electrophoresis pattern of Pvu IIRFLP of ESR gene PCR products in Tibetan pigs 2.4 西藏小型猪 ESR基因扩增片断 Pvu II多态性与生长繁殖性状间的关系 整理收集采样西藏小型猪母猪的初产和经产胎的产仔数、产活仔数和离乳成活数以及所产仔猪的初生体质量、离乳体质量（60 日龄体质量）等相关的生长繁殖数据，得到西藏小型猪 ESR基因座位不同基因型繁殖性能和早期生长性能数据，见表 1、表 2。 由表 1、表 2可以看出：在 ESR基因中，初产胎的产仔数在不同基因型差异有显著性 (
14、F=3.579,P0.05)，不同基因型间产仔数呈现BBABAA的趋势， BB基因型母猪的产仔数分别比 AB型和 AA型母猪多 0.264头和 1.400头，初产胎和经产胎的其他指标在不同基因型间差异均无显著性（P0.05） 。 表 1 西藏小型猪 ESR基因座位繁殖性能的基本统计资料（略） Table 1 ESR genotypes and their reproduction performances in Tibet minipigs 与不同基因型间比较：*P0.05 表 2 西藏小型猪 ESR基因座位早期生长性能的基本统计资料（略）Table 2 ESR genotypes and t
15、heir early growth performances in Tibet minipigs 3 讨论 3.1 ESR 基因的基因型及基因频率的分布 从整体上来看，与其他猪种相比可以看出西藏小型猪的 A等位基因频率和 B等位基因频率与梅山猪接近，并且与熊统安6等报道的有关西藏小型猪 ESR基因多态性分析的结果一致；其中 A等位基因频率比莱芜猪、长白猪、大白猪低，B 等位基因频率比其他大部分的地方猪种要低一些。ESR 基因的 A、B 等位基因的基因频率很接近，都接近 0.500，这也说明西藏小型猪选择压力较小, ESR 基因的分布处于原始的自然状态。 3.2 西藏小型猪 ESR基因扩增片断
16、Pvu II多态性与生长繁殖性状间的关联性 在本研究中，西藏小型猪 ESR基因初产胎的产仔数在不同基因型间差异有显著性 (P0.05)，不同基因型间产仔数呈现 BBABAA的趋势， BB 基因型母猪的产仔数分别比 AB型和 AA型母猪多 0.264头和1.400头，初产胎和经产胎的其他指标在不同基因型间差异无显著性( P0.05)。Rothschild7等用含 50%梅山猪血缘的 2个合成系涉及50个全同胞家系 161头母猪为材料，对 ESR基因进行 PFLPs分析，用Pvu Il酶切 PCR扩增产物后，纯合子 BB母猪第一胎产仔数和产活仔数都比纯合子 AA母猪多 2.3头(P0.01)，比所
17、有胎次多 1.5头(P0.01)。后在 PIC合成系(含大白猪血缘)发现 BB比 AA母猪第一胎产仔数和产活仔数高 1.2头，所有胎次高 0.9头。对上述 2次试验母猪群均记录了生长速度和背膘厚，分析后发现 ESR位点不同基因型性状均值间差异不显著。张淑君8,9等同样采用 PCRRFLPs 方法分析了长白与大白杂交猪、二花脸猪和大白猪的 ESR位点的多态性，并分析了多态性与母猪产仔数性能之间的相关性。结果表明:ESR 位点在 2个品种和长白与大白杂交母猪中均存在多态性，ESR 位点对产仔数的影响趋势为BBABAA。本研究结果与他人报道的基本一致,但是不同的基因型间产仔数的差异没有其他人所报道的
18、大，这主要是跟西藏小型猪的繁殖性能不高的品种特性有关。另外，西藏小型猪仔猪的初生体质量和离乳体质量在不同的基因型间差异均无显著性，这与田勇等的研究结果一致10 ，说明 ESR基因多态性对生长性能的影响不是很明显，所以在考虑ESR基因对西藏小型猪生长繁殖性能的影响时，主要是考虑 ESR基因对繁殖性能方面的影响，而对生长性能方面的影响可以不用考虑。 【参考文献】 1 VINCENT A L，WANG L，TUGGLE C K，et al. Prolactin receptor maps to pig chromosome 15J Mamm Genome，1997，8:793-794. 2ROTHS
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